痰瘀同治方药物血清对人脐静脉内皮细胞增殖和迁移的影响
时间：2021-04-23 07:58:28 来源：达达文档网 本文已影响 人 
摘要：目的 观察痰瘀同治方对人脐静脉内皮细胞增殖和迁移的影响，探讨其促血管生成作用。方法 体外培养人脐静脉内皮细胞模型，大鼠连续5 d灌胃不同剂量的痰瘀同治方（78.0、39.0、19.5 g/kg）制备各剂量药物血清，采用MTT法检测细胞活力来反应其增殖能力，用细胞划痕实验观察给药后细胞迁移能力。结果 与正常组比较，490 nm处吸光度痰瘀同治方高、中剂量组内皮细胞增殖能力明显增强（P<0.01），增殖率分别为49.78%、33.92%；内皮细胞迁移能力也有提高，划痕区相对距离明显减少（P<0.01），细胞迁移率分别增加11.36%、11.62%。结论 痰瘀同治方对人脐静脉内皮细胞有促进增殖和迁移的作用。
关键词：痰瘀同治方；人脐静脉内皮细胞；增殖；迁移
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）01-0050-03
血管新生是一个复杂的高度受控的过程，包括内皮细胞的分类、有选择的血管基底膜和周围细胞外基质降解、内皮细胞迁移，而后，新的毛细血管得以生长出来[1]。内皮在心血管疾病的发展过程中起着关键性
基金项目：国家科技重大专项-重大新药创制（2009ZX09303- 003、2009ZX09301-005-2-6）
通讯作者：刘建勋，E-mail：Liujx0324@sina.com
的作用，包括疾病发展时缺血后血管的生成与调节。内皮细胞的损伤及功能障碍与冠心病的发生发展有着密切联系，血管内皮细胞大量增殖与迁移是冠心病发病过程中血管新生的关键环节[2]。中医药关于活血化瘀、益气补血等药物的研究为中药促血管新生的研究提供了重要线索。痰瘀同治方由人参、丹参、黄连、川芎等药物组成，具有益气活血、化痰逐瘀功效，其药物血清对内皮细胞有直接保护作用[3-4]。本研究通过观察痰瘀同治方对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）增殖和迁移的影响，探讨痰瘀同治方对动脉内膜新生血管的形成和发展的作用。
1 实验材料
1.1 动物与细胞
SD雄性大鼠20只，体质量280～300 g，SPF级，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK（京）2006-0009。HUVEC来自健康产妇脐带，北京市海淀区妇幼保健院提供。
1.2 药物
痰瘀同治方（由丹参、川芎、山楂等中药组成）提取浸膏干粉，中国中医科学院西苑医院实验研究中心药学研究室提供，8.33 g原药材/g；血管内皮生长因子（VEGF）100 ng/L，BioCoatTM MatrigelTM。
1.3 主要试剂与仪器
M199培养基，批号M-200-500，Gibco公司；LSGS添加剂，批号S-003-10，Cascade Biologics公司；明胶，Sigma公司；磷酸盐缓冲液（PBS）、小牛血清（FBS）、1∶250胰蛋白酶，Gibco公司；Matrigel基质胶， Becton Dickinson公司。培养箱，银川市金属制品厂；MCO175型CO2培养箱，日本SANYO；超净工作台，北京昌平常常空气净化设备工程公司；TH4-200型倒置相差显微镜，日本Olympus公司；CMS800型微循环生物图像分析系统，美国GOLD Spring公司；IEC CL31R型离心机，美国Termo Scientific公司；SYNERGY4型酶标仪，Biotek公司。
2 实验方法
2.1 痰瘀同治方药物血清的制备
雄性SD大鼠，常规喂养。随机分为药物高、中、低剂量组和正常组。药物高、中、低剂量组按成人剂量的15、10、5倍灌胃，分别相当原药材为78.0、39.0、19.5 g/kg。正常组给予高剂量药方组等体积蒸馏水。每日灌胃2次，连续5 d。末次给药后1.5 h，用3.5%水合氯醛0.35 g/kg腹腔注射麻醉，打开腹腔，暴露腹主动脉，取血，室温静置，2000 r/min离心10 min，抽取血清，置56 ℃水浴20 min，微孔滤膜过滤除菌，分装后-20 ℃冰箱保存备用。
2.2 人脐静脉内皮细胞原代培养
参照文献[5]方法。取健康产妇脐带约20 cm，用PBS冲去残血，血管钳夹闭脐带一端，另一端用钝化针头插入，并用血管钳夹闭固定，注入约15 mL 1%Ⅰ型胶原酶，使胶原酶原充满脐带，37 ℃下消化12 min。收集消化液于培养皿中，用PBS充分冲洗脐静脉，消化液与冲洗液1500 r/min离心10 min。弃上清液，加入5 mL培养液（M199培养基添加50×LSGS和100×青链霉素混合液），轻轻吹打使细胞悬浮，将细胞移至培养瓶中，37 ℃、5%CO2孵箱中培养18 h后弃去培养液， PBS洗3遍，换入新细胞培养液继续培养。待细胞长至80%融合后，弃培养液，加入0.25%胰酶消化，传代。2～5代的HUVECs用于实验。
2.3 细胞增殖能力测定
参照文献[6-7]方法，取HUVECs经清洗，消化，制成细胞悬液。细胞计数后，每孔1×104/100 μL接种于96孔板。正常培养24 h后弃原培养液，换上只含有0.5%PBS的培养液预处理24 h，使细胞同步化。实验分为正常血清组和高、中、低剂量药物血清组。各组按20 μL/孔加入相应血清，每孔体积为120 μL。每组平行设6个复孔，继续常规培养48 h。弃去培养液，MTT法测定各孔酶标仪490 nm处吸光度（A值），计算增殖率[（药物血清组A值-正常血清组A值）÷正常血清组A值×100%]。
2.4 细胞迁移能力测定
取HUVECs经清洗，消化，制成细胞悬液，按每孔1×105/500 μL接种于24孔板。正常培养24 h后弃去细胞培养液，换上只含有0.5%PBS的培养液预处理24 h使细胞同步化。用移液器枪头（单位为100 μL）在各孔板底部中间划“一”字形划痕，在TH4-200型倒置相差显微镜和CCD相机AxioCamHRC下每孔任意选取3个视野拍照，记录划痕区的相对距离。实验分为正常血清组、空白组、阳性药组及高、中、低剂量药物血清组，正常血清组及各药物血清组按500 μL/孔加入相应血清，阳性药组按500 μL/孔加入100 ng/L VEGF，每个剂量组设3个复孔，空白组只加含有0.5% PBS和0.1%DMSO的培养液，继续培养16 h后，参照先前拍照方式记录加药后划痕区的相对距离，计算迁移率[（愈合前相对距离-愈合后相对距离）÷愈合前相对距离×100%]。
3 统计学方法
采用SPSS16.0统计软件进行分析。计量资料用—x±s表示，不同浓度药物血清组间比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 痰瘀同治方药物血清对人脐静脉内皮细胞增殖的影响
与正常血清组比较，痰瘀同治方高、中剂量药物血清组HUVEC增殖率均明显增加，分别为49.78%、33.92%，差异有统计学意义（P<0.01），见表1。
4.2 痰瘀同治方药物血清对人脐静脉内皮细胞迁移的影响
细胞划痕后16 h，痰瘀同治方高、中剂量药物血清组的划痕区相对距离明显减少，细胞迁移率分别为11.36%、11.62%。与正常血清组比较，差异有统计学意义（P<0.01），见表2。
5 讨论
血清药理学方法目前被广泛应用于中药药理学研究中，其可信度、科学性、可行性都较以往应用中药粗制剂直接体外给药的中药药理研究有一定优势：既能防止中药粗制剂本身理化性质对体外试验的干扰，又能反映中药在胃肠道消化吸收再经生物转化最后产生药理效应的过程，代表了药物在体内产生作用的真正有效成分。血管新生是从内皮细胞受到刺激增殖游走开始的，其过程包含了血管内皮细胞与周围细胞外基质间的相互作用，血管新生在人体组织修复及再生重建上有着重要的作用，胚胎发育、创伤愈合、脂肪增生以及女性经期子宫内膜建构等都须通过这一血管新生的过程，失去调控的血管新生广泛参与各种病理过程如动脉粥样硬化等的发展，所以维持其正常的生长和平衡对人体是最基本的要求[8]，因此，开展对血管新生有促进作用的中药研究有着积极意义。
痰瘀同治方具有行气活血、祛瘀化痰功效，可以很好地改善动脉粥样硬化和降低血脂浓度。本实验通过内皮细胞的增殖、迁移实验，对中药复方痰瘀同治方药物血清体外血管新生机制进行初步探讨。结果表明，痰瘀同治方高、中剂量药物血清对HUVEC增殖能力明显增强，增殖率分别为49.78%、33.92%。且使人脐静脉内皮细胞划痕区相对距离明显减少，细胞迁移率分别为11.36%、11.62%。可见，本实验中痰瘀同治方能明显地促进内皮细胞的增殖与迁移，提示其具有促血管新生效应。
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（收稿日期：2014-04-20；编辑：华强）
