22种中药多糖对猪源金黄色葡萄球菌的体外抑菌活性

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摘要：采用超声波辅助法对22种中药多糖进行提取，用牛津杯法和试管二倍稀释法测定中药多糖的抗菌活性。结果表明，川牛膝、黄芩、茯苓、地榆、虎杖等5种中药多糖对猪源金黄色葡萄球菌有较强的抑菌效果，抑菌圈在20 mm以上，最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）在3.9～7.8 mg/mL；9个复方提取物的体外抑菌结果表明，以黄芩、地榆、大黄、虎杖等中药为主的复方对猪源金黄色葡萄球菌具有良好的抑菌活性，其最大抑菌圈直径可达27.6 mm，MIC和MBC为3.9 mg/mL，表明它们在抗菌消炎方面具有较高的药用开发价值，在中药组方时可优先考虑。

关键词：中药多糖；金黄色葡萄球菌；抑菌活性；MIC；MBC；中药复方

中图分类号： S853.7；S855.1+1 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2016）09-0264-03

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）简称金葡菌，是一种常见的人畜共患病原菌，其在人医临床上常引起皮肤、口腔以及鼻腔黏膜等组织局部化脓感染，也可引起肺炎、心包炎、关节炎、骨髓炎、肠炎以及尿路感染等；在兽医临床常引起仔猪渗出性皮炎、牛羊乳房炎和子宫内膜炎、犬猫鼻炎以及鸡水肿病等多种动物疾病，若不及时治疗常引起败血症、脓毒症等全身感染导致动物死亡[1-3]。此外，由于金黄色葡萄球菌可以通过各种方式污染食品，因此该菌也是食品安全领域引起食物中毒的重要致病菌之一[4-6]。

近年来，随着养猪规模的不断扩大和养殖密度的不断增加，猪细菌性疾病的发生更加复杂严重，其中由金黄色葡萄球菌引起的仔猪渗出性皮炎在规模化猪场也日趋严重。然而，由于抗菌素在兽医临床的滥用，细菌耐药问题越来越突出[7-8]，临床很难筛选得到对金葡菌敏感的药物，一旦发病，死淘率可高达90%，给养猪业造成严重的经济损失。中药因其具有营养、保健、促生长以及药用低毒、低残留和不易产生耐药性等特点，已逐渐被国内外研究者重视[9-11]，并发现其对很多致病菌具有较强的抑制作用，有望成为抗菌素的替代药物或辅助药物。同时，随着社会对食品安全及无抗养殖的重视和关注，筛选对致病菌敏感、高效、低毒、低残留的中药来防控动物疾病已经成为当前兽医工作者研究的热点和趋势，也是发展健康无抗养殖急需解决的1个重要课题。本研究选择多糖含量较高的22种中药，采用超声波辅助法提取其多糖化合物，研究其对猪源金黄色葡萄球菌的体外抑菌活性，以期为兽医临床合理用药、有效防控猪金黄色葡萄球菌病提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 中药材

22种常用中药材 地榆（陕西）、大黄（四川）、虎杖（四川）、丹参（四川）、甘草（甘肃）、石榴皮（河南）、黄芪（陕西）、黄芩（甘肃）、茯苓（湖南）、苦参（内蒙古）、黄连（四川）、鱼腥草（四川）、柴胡（四川）、枸杞（宁夏）、白术（浙江）、升麻（陕西）、大枣（新疆）、何首乌（四川）、党参（四川）、山茱萸（陕西）、大叶茜草（四川）、川牛膝（四川）和蒲公英（贵州），购自绵阳天源堂大药房。根据中药复方的组方原则[12]，选择单味抑菌活性较好的中药辅以补益理气等药物，组成9个复方，具体情况见表1。

1.2 主要试剂及培养基

牛肉膏蛋白胨培养基、肉汤培养基、SS 培养基、麦康凯琼脂培养基等，购自北京奥博星生物技术有限责任公司；微量生化发酵管，购自青岛高科园海博生物技术有限公司；氢氧化钠、氯化钠、正丁醇、无水乙醇、丙酮等常规药品为化学纯，购自绵阳市信捷商贸有限责任公司。

1.3 供试菌种

猪源金黄色葡萄球菌，分离自绵阳市某规模化猪场仔猪渗出性皮炎病猪，由绵阳师范学院动物应用技术研究所鉴定保存。

1.4 中药多糖的提取

称取干燥、粉碎后的中药10 g，放入250 mL烧杯中，加入20倍的蒸馏水，65 ℃下超声波提取15 min，2层医用纱布过滤得提取液，滤渣重复上述操作，共得到3次提取液，合并3次提取液，低速离心10 min取上清液；浓缩至25 mL，以1 ∶3比例加入 95%乙醇，静置1夜，次日于离心机以 3 000 r/min 离心 20 min，去除上清液得到多糖沉淀，加蒸馏水定容至10 mL；加入 Sevage 试剂（正丁醇 ∶三氯甲烷=4 ∶1，Sevage ∶滤液=1 ∶5），3 000 r/min离心10 min，取上清液，重复2次可有效除去蛋白质等杂质，定容10 mL，具体方法参考文献[13-15]。全部药液用立式压力蒸汽灭菌器，121 ℃灭菌15 min，取出后置于4 ℃冰箱中保存备用。

1.5 菌悬液的制备

将保存的猪源金黄色葡萄球菌活化后，接种于普通琼脂斜面培养基，37 ℃恒温培养 18～24 h，每支斜面加入 1.5 mL灭菌蒸馏水，洗下菌液，调整细菌浓度为150万CFU/mL备用，具体方法参考文献[16]。

1.6 体外抑菌活性的测定

采用牛津杯法，将灭菌后的液体培养基倒入平板内，待其凝固后，用微量移液器吸取 0.1 mL稀释到一定浓度的菌悬液，滴入平板，用涂布器涂匀，用镊子轻轻在每个培养皿中等距离放入4个牛津杯，用微量加样器吸入含生药1 g/mL 的中药多糖溶液0.2 mL于对应牛津杯中，置于37 ℃条件下，恒温培养18～24 h，测量抑菌圈直径，具体参照文献[17]。

1.7 最小抑菌浓度（MIC）的测定

采用试管二倍稀释法，每11支为1组，在1～11号试管中各加入2 mL无菌营养肉汤，在1号试管中加入2 mL含生药1 g/mL 的中药多糖溶液混匀，取出 2.0 mL放入第 2管中，依次类推，直到第 9管取出2.0 mL弃去，则1～9号试管混合液中药提取物浓度依次为500、250、125、62.5、31.3、15.6、7.8、3.9、0.9 mg/mL，10号试管不含中药作对照，11号试管不加菌悬液观察是否染菌。将稀释成一定浓度的菌悬液用微量移液器吸取0.1 mL于1～10号试管中，37 ℃振荡培养18～24 h。观察透明无浑浊试管，选出浓度最低的试管药液，即为这种药物对该细菌的最小抑菌浓度（ MIC），具体方法参照文献[18]。

1.8 最低杀菌浓度（MBC）的测定

将上述选出的透明无浑浊试管，吸取菌药液0.1 mL加入培养基中，用涂布器涂布均匀，置于37 ℃恒温养 24 h。以99.9%杀死试验菌菌体的药物最高稀释度为最低杀菌浓度（MBC），具体方法参照文献[19]。

2 结果与分析

2.1 单味中药多糖的抑菌活性

由表2可知，22种中药多糖的初提物对猪源金黄色葡萄球菌的抑菌效果存在较大差异，其中川牛膝的抑菌活性最强，抑菌圈直径25.3 mm，MIC和MBC均为3.9 mg/mL，其次是黄芩、茯苓、地榆、虎杖等中药，其抑菌圈直径均在20 mm以上，具有极强的抑菌活性；而大枣、党参和大叶茜草3种中药对猪源金黄色葡萄球菌没有明显的抑菌效果。

2.2 复方中药多糖的抑菌活性

由表3可知，复方3和复方7明显比各单味药的抑菌效果都明显增强，对猪源金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径分别为26.3、27.6 mm，MIC和MBC均为3.9 mg/mL；而复方5和复方9均出现抗菌能力降低的现象。

3 结论与讨论

中药多糖的提取方法较多，不同的提取方法可影响其抑菌效果。其中，浸提法和醇沉法是传统常用的提取方法，其利用多糖不溶于乙醇的性质，在浓缩液中加乙醇，使多糖从提取液中沉淀出来。但因水的极性大，容易把蛋白质、苷类等水溶性成分浸提出来，使提取液存放时易腐败变质，为后续的分离带来困难，同时该法提取比较耗时，提取率也不高[21]，因此其使用受到限制。近年来，随着超声波技术的蓬勃发展，超声波提取技术（ultrasound extraction，UE）已成为提取中药有效成分的一种新方法，其具有低温、常压、安全、效率高、杂质少、能耗低等优点[22]。该法影响提取率的主要因素有时间、温度、提取次数和料液比等[23]，本研究通过条件优化，确定了提取时间20 min、提取温度65 ℃、料液比1 g ∶20 mL、提取次数3次的最佳提取条件，结果表明，该法操作简单、高效、方便，是一种极具发展潜力的提取方法，值得在中药提取实践中推荐使用。

在抑菌试验中，采用牛津杯法测定抑菌圈大小、试管二倍稀释法测定最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC），是测定药物效价和活性的通用方法，也是各国药典规定的方法[24]。从本研究结果看，22种中药抑菌圈大小、MIC和MBC三者之间的数据相关性基本相符合，说明试验结果可靠。单味中药的抑菌试验结果显示，22种中药多糖的提取物对猪源金黄色葡萄球菌的抑菌效果存在较大差异，其中川牛膝的抑菌活性最强，抑菌圈直径25.3 mm，MIC和MBC均为3.9 mg/mL；其次是黄芩、茯苓、地榆、虎杖等中药，其抑菌圈直径均在20 mm以上，也具有较强的抑菌活性；而大叶茜草、大枣和党参3种中药对猪源金黄色葡萄球菌没有明显的抑菌效果。综合比较分析发现，22种中药的整体抑菌强弱顺序为川牛膝>黄芩>茯苓>地榆>虎杖>大黄>石榴皮>丹参>何首乌>柴胡>黄芪>蒲公英>升麻>甘草>山茱萸>枸杞>苦参>鱼腥草>黄连>大叶茜草=大枣=党参。川牛膝因具有祛风利湿、通经活血等功效，常用于产后跌打损伤、胞衣不下、尿血血淋、风湿痹痛等病症[25]，未见其有抗菌抑菌作用的报道，而本研究结果表明川牛膝在22种中药中抑菌活性最强，提示川牛膝可能在抗菌消炎药方面具有一定的应用价值，这为川牛膝的进一步开发应用提供了参考。杨海燕等研究结果表明，黄芩、茯苓、地榆、虎杖等中药对金黄色葡萄球菌具有较强的抑制作用，与本研究结果相符，说明这些中药在抗菌中药的开发中具有良好的应用前景[26-28]。但在具体的抑菌圈大小和MIC或MBC数值上，本研究结果与相关报道又存在一定差异，其原因可能与中药的产地、提取方法、以及抑菌试验测定方法的不同等有关，说明在应用中药时要充分考虑这些因素的影响。值得注意的是，在党参多糖提取物的抑菌试验中，不仅没有出现抑菌圈，并且在装有党参多糖提取物的牛津杯周围，金黄色葡萄球菌的菌落反而更加密集，说明党参多糖可能具有促进细菌生长的作用，其具体机理有待进一步研究。

基于单味中药的抑菌试验结果，结合中药的配伍原则，笔者对9个中药复方多糖提取物进行体外抑菌试验，结果表明，以黄芩、地榆、大黄、虎杖等中药为主的复方多糖提取物对猪源金葡菌具有良好的抑菌活性，其最好的组方抑菌圈直径可达27.6 mm，MIC和MBC为3.9 mg/mL，表明它们在抗菌消炎等方面具有较高的药用开发价值，在中药组方时可优先考虑。MIC和MBC值是兽医临床选药用药的主要依据[29]。从本研究的MIC或MBC数值上看，某些复方中药的MIC或MBC值低于单方，表明此复方效果优于单方。而有些复方的MIC或MBC值高于单方，说明可能是此类组方中含有无抑菌效果或抑菌效果差药物，从而使得复方制剂总质量增加而有效活性物质降低的结果，如本研究中的党参、黄连、白术等中药组方。但是，由于复方药物是基于动物机体整体出发，兼顾了各种药物成分的药理、药性以及之间的相互作用，发挥的是不同药物的复合作用和对机体的整体效应。因此，在抑菌活性相差不大的情况下，中药复方在动物疾病的防控方面可能较单方更合理、更有效、更科学，而对于不同复方究竟在临床生产中的运用效果如何仍需要进一步研究。

金黄色葡萄球菌是一种分布广泛且对人类和动物危害严重的病原菌，筛选有效药物控制该病不仅可降低畜禽养殖业的经济损失，同时对人类健康和食品安全具有重要意义。中药作为我国的优势国药，其资源丰富，来源广泛，具有作用广泛、毒副作用小和不易产生耐药性等特点，是抗生素替代药物研究的新方向，对疾病的预防和治疗具有广阔的应用前景，本研究结果可为兽医临床合理用药、有效防控猪葡萄球菌病提供科学参考。

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