基于化学成分和药理效应的荆芥传统分段加工与一体化加工工艺比较

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[摘要] 测定荆芥经饮片一体化加工与传统分段加工后所得产品中挥发油的含量，并采用GC-MS测定挥发油中8个代表性化合物（薄荷酮、胡薄荷酮、1-辛烯-3-酮、d-柠檬烯、β-石竹烯、β-香叶烯、薄荷呋喃、3-辛酮）的含量，通过二甲苯致小鼠耳廓肿胀模型，考察荆芥2种加工方法抗炎作用的差异。通过对荆芥不同加工产品挥发性成分含量与功效的比较，阐述荆芥药材、饮片一体化加工工艺的合理性。结果显示，荆芥一体化工艺加工产品8个化合物含量均高于传统工艺产品；2种加工方法均能降低小鼠耳廓肿胀度、降低致炎小鼠血清中TNF-α，IL-1β和IL-6的含量，产生抗炎作用。经过同剂量间比较，一体化加工工艺的抗炎作用整体上优于传统加工工艺。相比传统分段加工工艺，一体化加工在保证饮片质量的同时，提高了效率、节约时间及人工成本，具有合理性。

[关键词]荆芥； 一体化； 化学成分； 抗炎

[Abstract]The GC-MS method was adopted to determine the contents of β-myrcene， limonene， menthone， menthofuran， pulegone， β-caryophyllene， 1-octen-3-one and 3-octanone in volatile in Schizonepetae Herba processed by traditional processing and integration processing methods. The efficacies of Schizonepetae Herba with different processing methods were detected based on the inhibition of ear swelling induced by dimethylbenzene in mice. The rationality of the integration processing was expounded based on the comparison of chemical constituents and their pharmacological effects. The results showed that the contents of the eight chemical components in the products processed with the integrated processing method were higher than those processed with the other method. And both of the processing methods could reduce the degree of swelling and the content of TNF-α/IL-1β/IL-6 in mice serum. However， the anti-inflammatory efficacy of the products processed with the integration processing method was superior to that processed with the other method. Compared with the traditional processing method， the integration processing method ensures the quality of decoction pieces， with lower time and labor costs and higher efficiency.

[Key words]Schizonepetae Herba； integration； chemical component； anti-inflammatory

doi：10.4268/cjcmm20161117

荆芥是唇形科植物荆芥Schizonepeta tenuifolia Briq.的干燥地上部分，又名假苏，始载于《神农本草经》^[1]，为临床常用中药，性温、味辛，以全草入药，具有解表散风、透疹、消疮之功效，主治风寒感冒、咽喉肿痛及多种皮肤病^[2-3]。现代药理研究表明荆芥具有抗病毒、解热、抗菌、抗过敏、镇痛、降温等作用^[4-7]，在解表药中其地位独特而重要^[8-9]。挥发油类成分是其抗炎的主要物质基础之一，沸点较低，容易挥发散失，而且对日光及温度较敏感，易于分解变质^[10]。2015年版药典中规定荆芥的产地加工方法主要是除杂后干燥成药材，需制成饮片时，将荆芥药材除去杂质后喷淋清水，洗净润透，于50 ℃烘1 h，再经切段干燥即得。综合其加工过程，药材加工成饮片时需水处理及重复干燥，会造成挥发油及其他水溶性成分的损失，且分段加工干燥时间长，效率低下，雨天易霉烂变质、容易被鼠、虫、灰尘等污染，药材含水量、质量难以稳定^[11]。为避免分段加工造成的有效成分的流失、降低药材饮片加工的时间及人工成本，本实验室前期探索了荆芥药材、饮片一体化加工工艺，现拟通过比较传统加工饮片与一体化加工饮片有效成分含量与功效的异同，探讨荆芥药材、饮片一体化工艺的可行性与合理性。

1 材料

薄荷酮、胡薄荷酮对照品（中国食品药品检定研究院，批号分别为 111705-201205，111706-201205）； 1-辛烯-3-酮、d-柠檬烯、β-石竹烯对照品均购自Tokyo Chemical Industrial公司（日本）；β-香叶烯、薄荷呋喃、3-辛酮对照品均购自Sigma-Aldrich公司（奥地利），对照品纯度均大于98%；萘（内标，国药集团化学试剂有限公司，分析纯）；正戊烷（内标，国药集团化学试剂有限公司，GC级）；乙酸乙酯为色谱纯；阿司匹林购自南京白敬宇制药有限责任公司（批号140601）；二甲苯（批号20110410，江苏永华精细化学品有限公司）；羧甲基纤维素钠（CMC-Na，批号F20101222，国药集团化学试剂有限公司）；小鼠白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、Elisa试剂盒（南京森贝伽生物科技有限公司，批号分别为SBJ-R0024，SBJ-M0044，SBJ-M0010）。

荆芥于2014年10月采自河北安国，经南京中医药大学吴啟南教授鉴定为唇形科植物荆芥S.tenuifolia的地上部分。

Agilent 6890N-5975B气相色谱-质谱联用仪、Agilent ChemStation化学工作站软件（美国 Agilent公司）；B211D 电子天平（1/10万，赛多利斯科学仪器有限公司）。

ICR小鼠，SPF级，雄性，体重（20±2） g。由浙江省实验动物中心提供，合格证号SCXK（浙）2013-0016。

2 方法

2.1 荆芥挥发油含量及其所含成分的定量测定^[12]

2.1.1 GC-MS条件 色谱柱： HP-5MS毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；进样口温度200 ℃；载气氦气，载气流速1.0 mL·min^-1；分流比20∶1；程序升温：初始温度为50 ℃，以10 ℃·min^-1升温至90 ℃，保持6 min，再以8 ℃·min^-1升温至150 ℃，保持2 min；进样量1 μL；电轰击电离源（EI）；电子能量70 eV；四级杆度150 ℃；离子源温度230 ℃；接口温度280 ℃；扫描范围m/z40～400。GC-MS图见图1。

2.1.2 样品制备 一体化加工方法：鲜荆芥除杂后50 ℃干燥5 h，切段（1 cm），40 ℃干燥3 h干燥成饮片。传统加工方法：除去杂质，晒干，制得药材。取药材喷淋清水，洗净，润透，于50 ℃烘1 h，切段（1 cm），40 ℃干燥3 h得饮片。挥发油的提取：取荆芥饮片适量，照《中国药典》2015年版四部 “挥发油提取法”甲法提取挥发油，计算得率。提取的挥发油加入适量无水Na²SO⁴静置保存。

2.1.3 内标溶液的制备 取萘和正癸烷适量，置100 mL量瓶中，加乙酸乙酯溶解并稀释至刻度，摇匀，即得（每1 mL含萘1.73 mg，正癸烷0.29 mg）。

2.1.4 供试品溶液的制备 取加入适量无水Na²SO⁴静置1 h后的荆芥挥发油约50 mg，精密称定，置10 mL量瓶中，加乙酸乙酯溶解稀释至刻度，摇匀，精密量取该溶液和内标溶液各1 mL置10 mL量瓶中，加乙酸乙酯溶解并稀释至刻度。

2.1.5 对照品溶液的制备 精密称取对照品3-辛酮12.47 mg、β-香叶烯10.91 mg、薄荷酮160.35 mg、1-辛烯-3-酮13.64 mg、D-柠檬烯21.18 mg、薄荷呋喃14.07 mg、胡薄荷酮270.42 mg、β-石竹烯12.95 mg，分别置10 mL量瓶中，加乙酸乙酯溶解并稀释至刻度，摇匀，即得各待测化合物的对照品溶液。精密量取3-辛酮溶液0.5 mL、β-香叶烯0.3 mL、薄荷酮2 mL、1-辛烯-3-酮0.5 mL、D-柠檬烯1 mL、薄荷呋喃1 mL、胡薄荷酮2 mL、β-石竹烯1 mL置同一10 mL量瓶中，加乙酸乙酯稀释至刻度，摇匀，即得对照品混合溶液。荆芥中8个化合物MS监测数据见表1。

2.1.6 线性关系的考察 分别精密量取对照品混合溶液0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL置10 mL量瓶中，分别精密加入内标溶液 1 mL，加乙酸乙酯溶解并稀释至刻度，摇匀。分别吸取上述6份溶液各1 μL，进样，按内标法以峰面积计算。以各待测化合物与内标的峰面积比值（y）为纵坐标，各待测化合物质量浓度（x，mg·L^-1）为横坐标，进行线性回归，得回归方程。各化合物线性关系考察结果见表2。

2.1.7 精密度试验 精密量取对照品混合溶液1 mL置10 mL量瓶中，精密加入内标溶液1 mL，加乙酸乙酯稀释至刻度，摇匀，即得精密度试验溶液。连续进样6次，计算各待测化合物峰面积与内标峰面积的比值，计算RSD，结果为8种化合物的RSD为1.4%～2.4%，表明本方法精密度良好，具体结果见表3。

2.1.8 重复性试验 取同一荆芥饮片所得挥发油6份，分别按2.1.4项下方法制备供试品溶液，照上述试验条件进样测定，计算各待测化合物峰面积与内标峰面积的比值，按内标法计算含量，计算RSD，结果为8种化合物的RSD为2.3%～2.9%，表明本方法重复性良好，具体结果见表3。

2.1.9 稳定性试验 取同一份荆芥挥发油供试品溶液，照上述试验条件分别在0，2，4，6，8，12 h进样测定，计算各待测化合物峰面积与内标峰面积的比值，计算RSD，结果为8种化合物的RSD为1.5%～2.3%，表明供试品溶液在12 h内稳定，具体结果见表3。

2.1.10 加样回收试验 取已知待测化合物含量的同一荆芥挥发油约50 mg，共6份，精密称定，置10 mL量瓶中，分别加入薄荷酮对照品溶液和胡薄荷酮对照品溶液各1 mL，加入3-辛酮对照品溶液、β-香叶烯对照品溶液和d-柠檬烯对照品溶液各0.1 mL，加入1-辛烯-3-酮对照品溶液和β-石竹烯对照品溶液各0.3 mL，加入薄荷呋喃对照品溶液0.5 mL，用乙酸乙酯溶解稀释至刻度，摇匀，精密量取该溶液和内标溶液各1 mL置10 mL量瓶中，加乙酸乙酯溶解并稀释至刻度。照上述试验条件进样测定，以各待测化合物与内标的峰面积比值按内标法计算样品含量，再计算加样回收率，结果见表3。

2.1.11 样品测定 分别取3个批次的鲜荆芥，每个批次分为2份，分别按2.1.2项下制备2个加工工艺的样品。取每份样品适量，按2.1.4项下制备供试品溶液。照上述实验条件进行测定，以各待测化合物与内标的峰面积比值按内标法计算待测成分含量，再以含油量换算饮片中各待测成分的含量，取平均值，结果见表4。

2.2 2种工艺产品抗炎作用的比较

2.2.1 分组与给药 取ICR小鼠90只，随机分为空白组、模型组、阳性组、一体化高、中、低剂量组（1.5，3.0，6.0 g·kg^-1）、传统高、中、低剂量组（1.5，3.0，6.0 g·kg^-1），每组10只。二甲苯致炎前每天上午9：00和下午4：00灌胃给药，连续给药3 d。阳性组给予阿司匹林混悬液，一体化高、中、低剂量组分别给予不同浓度的荆芥一体化工艺产品粉末混悬液，传统高、中、低剂量组分别给予不同浓度的荆芥传统工艺产品粉末混悬液，空白组和模型组给予等体积的0.5% CMC-Na溶液，各组小鼠每次灌胃给药体积均为15 mL·kg^-1（体重）。

2.2.2 模型制备与耳肿胀度检测 末次给药1 h后，除空白组外，各组小鼠于左耳正反两面涂抹0.04 mL二甲苯致炎，右耳做对照。1 h后将小鼠脱颈处死，沿耳廓基线剪下两耳，用直径7 mm的打孔器分别在同一部位打下圆耳片，称重，以左右耳片重量之差与右耳的比值为肿胀度。

2.2.3 ELISA法检测荆芥对耳肿胀小鼠血清TNF-α，IL-1β和IL-6含量的影响 二甲苯致炎1 h后眼框取血，血样静置30 min后3 000 r·min^-1离心10 min，取上清，ELISA法检测血清中TNF-α， IL-1β和IL-6含量。

2.2.4 数据处理 数据用±s表示，采用SPSS 20.0进行统计学分析，以P<0.05为有统计学意义。

3 结果

3.1 一体化工艺与传统工艺加工产品化学成分的比较

相比传统加工工艺产品，一体化加工工艺产品中挥发油与8个待测成分的含量均有所增加，见表4。

3.2 对二甲苯致耳廓肿胀小鼠肿胀度的影响

与模型组比较，阳性药抑制肿胀作用明显，荆芥一体化工艺和传统工艺产品各剂量均能降低小鼠耳廓肿胀度，高、中剂量作用尤其显著（P<0.01或P<0.05）。经同剂量间比较，传统工艺产品中剂量的抑制肿胀作用效果明显优于一体化工艺产品中剂量（P<0.05）；与传统高剂量组比较，一体化高剂量组小鼠耳廓肿胀度的降低更加显著（P<0.01），见表5。

3.3 对二甲苯致耳廓肿胀小鼠的血清中TNF-α，IL-1β，IL-6含量的影响

与空白组比较，模型组小鼠血清中TNF-α，IL-1β，IL-6的含量显著增加（P<0.01）。与模型组比较，阳性药明显降低小鼠血清中TNF-α的含量（P<0.05），荆芥一体化中、高剂量组显著降低小鼠血清中TNF-α的含量（P<0.01），且一体化中剂量组的作用明显强于同计量的传统组（P<0.05）；各给药组均能显著降低小鼠血清中IL-1β和IL-6的含量（P<0.01或P<0.05），同剂量组之间比较，一体化工艺产品对于小鼠血清中IL-1β，IL-6含量的影响略优于传统工艺产品，但无显著的统计学差异，见表5。综合来看，相比较于荆芥传统分段加工产品，荆芥一体化工艺产品的抗炎效果较强。

4 讨论

现代中医学研究认为，表证症状与炎症这一基本病理过程紧密相连，解表药的抗炎作用是其发挥解表功效的重要药理基础之一，因而研究荆芥抗炎作用及作用机制是研究荆芥的解表作用的重要途径^[13]。本实验通过比较小鼠的肿胀度以及血清中TNF-α，IL-1β和IL-6含量，来考察荆芥一体化工艺和传统工艺产品高、中、低3种剂量饮片粉末的抗炎作用。TNF-α作为炎症反应的重要介质，通过增高微血管壁通透性和趋化、增强中性粒细胞与血管内皮细胞的黏附性激活炎性细胞。IL-1β和IL-6介导中性粒细胞等炎性细胞到局部病灶，是炎症性疾病中的重要因素^[14]。在本实验中，荆芥一体化工艺产品与传统工艺产品均能降低小鼠血清中TNF-α，IL-1β和IL-6炎症细胞因子的含量，降低小鼠耳廓肿胀度，发挥抗炎作用。

研究表明，挥发油是荆芥的主要药效成分，其药效作用可能是几种成分的加和或协同作用，不同成分组成或主要成分比例有较大差异的荆芥挥发油，药效和急性毒性相差很大^[15-16]。前期研究发现，胡薄荷酮、薄荷酮、柠檬烯、3-辛酮、1-辛烯-3-酮、β-香叶烯、β-石竹烯、薄荷呋喃在荆芥挥发油中占有很高的比例，其中胡薄荷酮、薄荷酮和柠檬烯的含量最高，为挥发油的主要药效成分，故本实验选取荆芥挥发油中主要的8种成分作为指标，考察一体化工艺与传统工艺的挥发性成分差异。结果发现，荆芥一体化工艺产品折干后挥发油含油量为1.08%，传统工艺产品折干后挥发油质量分数为0.55%，明显低于一体化工艺产品，所以其胡薄荷酮等8个成分的含量远低于一体化工艺产品。

本课题前期已采用正交实验优化荆芥一体化加工工艺参数（本部分正在申报专利），一体化工艺产品含油量较高是因为只经过一次干燥加工过程，避免了挥发油的流失。挥发油乃热不稳定性成分，重复干燥过程势必会造成其含量的降低。荆芥采收后经产地加工为干燥药材，此时的荆芥叶、穗质地较脆，在包装、运输及饮片加工过程中易脱落造成损失，以致挥发油含量降低。而一体化工艺产品是由荆芥采收后直接切段干燥成饮片，减少荆芥叶、穗在长途运输过程中的脱落损失，保证了饮片质量。此外，传统加工还经过水处理，两个工艺产品的水溶性成分及其他成分是否存在差异还需进一步的研究与探索。

药效研究结果表明，一体化工艺产品的抗炎作用整体上优于传统工艺，结合化学成分比较分析的结果，一体化工艺产品挥发油及其中各个组分的含量均高于传统工艺产品，故推断一体化工艺产品挥发油成分较高与其抗炎效果优于传统工艺产品之间有密切相关性。此外，工业化生产中一体化工艺不仅能够保证饮片质量，更能够提高加工效率，节约时间及人工成本。因此荆芥药材、饮片一体化加工有其一定的可行性及合理性。

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[责任编辑 孔晶晶]