姜黄素对APP/PS1双转基因小鼠海马PI3K及pPI3K表达的影响

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[摘要] 目的：观察姜黄素对AD模型APP/PS1双转基因小鼠磷酯酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol3kinase， PI3K）和磷酸化磷酯酰肌醇3激酶（phosphorylated phosphatidylinositol3kinase， pPI3K）表达的影响。方法：将3月龄的APP/PS1双转基因小鼠随机分为模型组、罗格列酮组（10 mg·kg-1·d-1）、姜黄素高、中、低剂量组（400，200，100 mg·kg-1·d-1），对照组为同月龄同背景的非转基因小鼠。连续灌胃3个月后，应用免疫组织化学和Western blot方法检测小鼠海马中PI3K和pPI3K的蛋白表达。结果：免疫组化染色模型组小鼠大脑海马CA1区PI3K和pPI3K阳性细胞均较对照组明显减少（P<0.05）；与模型组相比，各干预组PI3K及pPI3K阳性细胞均有不同程度的增加，而以罗格列酮组与姜黄素中剂量组阳性细胞恢复最为显著（P<0.01）。Western blot检测结果与免疫组化结果基本一致。结论：姜黄素可以使APP/PS1双转基因小鼠海马中已减少的PI3K和pPI3K蛋白有所恢复，提示姜黄素可能通过调节PI3K途径的胰岛素信号转导通路发挥抗AD作用。

[关键词] 姜黄素；APP/PS1双转基因小鼠；磷酯酰肌醇3激酶；磷酸化磷酯酰肌醇3激酶

[稿件编号] 20130129014

[基金项目] 国家自然科学基金面上项目（81073076）；教育部高等学校创新团队项目（IRT0810）

[通信作者] *王蓬文，博士，教授，博士生导师，Tel：（010）84013195

[作者简介] 党惠子，博士研究生，Email：danghz@163.com

迄今为止，阿尔茨海默病（Alzheimer′s disease， AD）的发病机制还不十分确切，国外学者和本课题组以往的研究表明，脑内胰岛素缺乏及胰岛素抵抗所致的脑胰岛素信号转导障碍是散发性AD（sporadic AD， SAD）神经变性病级联反应的核心环节[14]。PI3K途径是目前公认的主要胰岛素信号通路之一。PI3K可通过激活AKT/蛋白激酶B（protein kinase B， PKB）和抑制糖原合酶激酶3（glycogen synthase kinase3， GSK3β）来刺激葡萄糖运输和抑制细胞凋亡。损伤的胰岛素信号通路可以通过降低PI3K和AKT活性以及提高GSK3β的活性[2]，导致tau蛋白的超磷酸化，并在细胞内聚集为双螺旋丝，最终可造成神经元的死亡和丢失。因此，PI3K，尤其是其磷酸化活化形式pPI3K蛋白的表达在AD发生发展的病理过程中起着至关重要的作用。研究表明，中药单体姜黄素可通过抗炎、抗氧化、抑制β淀粉样蛋白（βamyloid，Aβ）聚积、调节胰岛素转导通路等多种机制发挥抗神经退行性变的作用[57]，本研究从胰岛素转导通路的PI3K途径，进一步研究中药单体姜黄素对PI3K和pPI3K表达的影响，为寻找具有神经保护作用的姜黄素的潜在标靶提供依据。

1 材料

1.1 试剂与仪器 姜黄素为美国SigmaAldrich公司产品（批号c1386）；羧甲基纤维素钠（carboxymethyl cellulose，CMC） 为北京精求化工有限责任公司产品（批号3405005），用前配成0.5%浓度，储存于4 ℃冰箱；马来酸罗格列酮片为葛兰素史克（天津）有限公司产品（批号09060108）；一抗兔抗小鼠PI3K与pPI3K抗体均为Abcam公司产品（免疫组化PI3K效价1∶100，pPI3K效价1∶50；Western blot效价均为1∶500）；SABC免疫组化染色试剂盒、DAB显色试剂盒均为武汉博士德生物工程有限公司产品；Western blot常规试剂RIPA组织/细胞裂解液、SDSPAGE凝胶配制试剂盒、Tris base、十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）、脱脂奶粉、过硫酸胺（ammonium persulfate，APS）、甘氨酸均为北京环亚泰克生物医学技术有限公司产品；ECL超敏底物化学发光检测试剂盒为尚柏生物医学技术（北京）有限公司产品；PVDF膜为MILLIPORE公司产品。MiniPROTEAN 3电泳仪为BIORAD公司产品。

1.2 动物 3月龄APP/PS1双转基因小鼠60只与同月龄同背景C57/BL6J小鼠12只，购于中国医学科学院动物研究所，许可证号SCXK（京） 20090004，体重22～25 g，于北京中医药大学东直门医院中药药理学实验室屏障环境动物室中饲养[SYXK（京）20090028]。小鼠饲料为清洁级维持鼠料，由北京科澳协力饲料有限公司供给[SCXK（京） 20050007]，饮用水为消毒水。小鼠垫料为消毒垫料，由中国医学科学院实验动物研究所提供。实验过程中动物自由摄食和饮水。

2 方法

2.1 分组及给药方法 将AD模型动物APP/PS1双转基因小鼠随机分为模型组、罗格列酮组（10 mg·kg-1·d-1）、姜黄素高、中、低剂量组（400，200，100 mg·kg-1·d-1），每组12只。于3月龄时对小鼠分别实施灌胃治疗，每日1次，连续灌胃3个月。对照组为同数量同月龄同背景非转基因小鼠。模型组和对照组给予等体积0.5%CMC灌胃。

2.2 取材及标本制备 将部分小鼠快速断头处死，剥离海马，分别置于EP管中，于-180 ℃液氮罐中储存备用，每组各6只，左右海马。其余小鼠于末次行为学测试后，以多聚甲醛进行心脏灌注，石蜡包埋、切片。每只小鼠脑于海马CA1区出现后连续冠状切片，每张切片厚4 μm。每组各6只。

2.3 免疫组织化学检测及分析 按说明书对相邻部位的脑片进行免疫组化染色。每只小鼠选取5张脑片，在20倍物镜下观察，记数海马CA1区内染色阳性神经细胞数目；并使用Imagepro Plus图象分析系统采集图像并进行分析，记录每组图像阳性细胞数和阳性细胞平均灰度值。灰度值反映的是一个点的颜色深浅程度，分为256（0～255）个灰度值，颜色越深，灰度值越小。

2.4 Western blot检测 蛋白质提取、蛋白质电泳、转膜、封闭、抗原抗体反应，转膜时蛋白面朝上，置于洁净保鲜膜上。用吸管将配制的发光检测液转移到蛋白膜上，使其均匀覆盖，室温孵育1～2 min。赶出其间的气泡，固定在X线片暗盒内。在暗室中取1张X线片置于包裹的膜上，合上暗盒，曝光30 s至1 min。随即显影定影，根据其曝光强度，缩短或延长下一张X线片的曝光时间。使用Hp Scanjet G4050将Western blot胶片扫描成TIF格式图片，用quantity one分析软件对各组条带进行分析，将各组的整合灰度比例与内參（βactin）比较，并以βactin的ID为100%，得到相对百分数，即 ID/内参ID×100%。

2.5 统计学分析 所得数据以±s表示，采用统计软件SPSS 17.0进行统计分析，组间数据比较用单因素方差分析（OneWay ANOVA）。以P<0.05为有显著性差异，以P<0.01为有非常显著性差异。

3 结果

3.1 免疫组化法检测APP/PS1双转基因小鼠海马CA1区神经元PI3K的表达 阳性反应细胞胞浆和胞膜着色，胞浆内有棕黄色的阳性反应颗粒。海马CA1区阳性细胞体积较大，呈圆形或椭圆形。模型组较对照组小鼠PI3K阳性细胞计数明显减少（P<0.05）；与模型组小鼠相比，罗格列酮组和姜黄素中剂量组小鼠PI3K阳性细胞显著增加（P<0.01），姜黄素高、低剂量组阳性细胞数亦有增加，但无统计学差异。Motic图像分析系统显示，模型组小鼠海马CA1区阳性细胞平均灰度值较对照组小鼠增加，染色变浅（P<0.05），罗格列酮组和姜黄素中剂量组小鼠海马CA1区PI3K阳性细胞平均灰度值同模型组小鼠相比明显降低，染色深（P<0.05），姜黄素高、低剂量组阳性细胞平均灰度值较模型组稍有降低，染色略深，但无统计学差异 （表1）。

表1 各组间海马CA1区PI3K阳性神经细胞数目和阳性细胞灰度值的比较（±s，n=6）

Table 1 Number and average gray value of PI3K positive cells in hippocampal CA1 area in each group（±s，n=6）

注：与对照组相比1）P<0.01，2） P<0.05；与模型组相比3） P<0.01，4）P<0.05（表2，图1，2同）。

3.2 Western blot检测APP/PS1双转基因小鼠海马PI3K的表达 蛋白表达条带模型组比对照组小鼠明显变窄、颜色变浅（P<0.01）；与模型组小鼠相比，姜黄素中剂量组和罗格列酮组蛋白表达条带均明显变粗、颜色变深（P<0.01），姜黄素高剂量组蛋白表达条带也变粗，颜色变深（P<0.05），姜黄素低剂量组蛋白表达条带略粗，颜色略深，但无统计学差异（图1）。

a.正常对照组；b.模型组；c.罗格列酮组；d.姜黄素高剂量组；e.姜黄素中剂量组；f.姜黄素低剂量组（图2同）。

图1 姜黄素对APP/PS1双转基因小鼠海马PI3K表达的影响

Fig.1 The effect of curcumin on the expression of PI3K of hippocampus of the APP/PS1 double transgenic mice

3.3 免疫组化法检测APP/PS1双转基因小鼠海马CA1区神经元pPI3K的表达 阳性反应细胞胞浆着色，胞浆内有棕黄色的阳性反应颗粒；阳性细胞体积较大，呈圆形或椭圆形。模型组较对照组小鼠海马CA1区pPI3K阳性细胞计数显著减少（P<0.01）；与模型组小鼠相比，各治疗组小鼠海马CA1区pPI3K阳性细胞明显增加（P<0.05）。Motic图像分析系统显示，模型组小鼠海马CA1区阳性细胞平均灰度值较对照组小鼠显著增加，染色变浅（P<0.01），罗格列酮组和姜黄素中剂量组小鼠海马CA1区pPI3K阳性细胞平均灰度值同模型组小鼠相比显著降低，染色较深（P<0.01），姜黄素高剂量组同模型组相比平均灰度值明显降低，染色变深（P<0.05），姜黄素低剂量组同模型组相比平均灰度值稍有降低，染色稍深，但无统计学差异（表2）。

3.4 Western blot检测APP/PS1双转基因小鼠海马pPI3K的表达 模型组与对照组相比蛋白条带明显变窄、颜色变浅（P<0.01）；与模型组小鼠相比，姜黄素中剂量组和罗格列酮组小鼠海马pPI3K蛋白表达条带均显著变粗、颜色较深（P<0.01），姜黄素高剂量组蛋白表达条带也变粗、颜色变深（P<0.05），姜黄素低剂量组蛋白表达条带略粗，颜色略深，但无统计学差异（图2）。

表2 各组间海马CA1区pPI3K阳性神经细胞数目和阳性细胞灰度值的比较（±s，n=6）

Table 2 Number and average gray value of pPI3K positive cells in hippocampal CA1 area in each group（±s，n=6）

图2 姜黄素对APP/PS1双转基因小鼠海马pPI3K表达的影响

Fig.2 The effect of curcumin on the expression of pPI3K of hippocampus of the APP/PS1 double transgenic mice

4 讨论

胰岛素信号通路可以调节葡萄糖的利用、代谢，能量产生，调控神经元存活，基因表达和可塑性[8]。胰岛素与胰岛素受体（insulin receptor， InR）或胰岛素样生长因子1 （insulinlike growth factors， IGF1）受体结合后，酪氨酸磷酸化胰岛素受体底物（insulin receptor substrate， IRS）。IRS激活后的信号转导通路，目前较为公认的主要有3条：磷酯酰肌醇3蛋白激酶（phosphatidylinositol 3kinase， PI3K）、丝裂原激活的蛋白激酶（mitogen activated protein kinases， MAPK）和磷酯酶C（phospholipase C， PLC）等通路，其中PI3K途径是主要的信号转导通路[23]。该途径的信号分子包括上游的InR，IRS以及下游的PI3K，磷脂酰肌醇依赖性激酶（phosphotidylinositidedependent kinases， PDK），AKT，GSK3β等。AD脑内胰岛素基因的表达减少伴随PI3K/AKT存活信号通路的受损。PI3K是胰岛素信号向调节糖代谢方向传递的关键蛋白，由含SH2 结构域的p85 调节亚基和具有酶活性的p110 催化亚基组成。PI3K首先通过p85亚基的SH2结构域与IRS结合而被激活，从而锚定在细胞膜上，进而作用于下游的信号分子PDK （包括PDK1和PDK2 2种），AKT等，一方面可调节影响葡萄糖吸收的葡萄糖转运子4（glucose transporter 4， GLUT4）向细胞表面募集，另一方面调节细胞生长、增殖、分化[910]。此外，PI3K还可通过抑制GSK3β来刺激葡萄糖运输和抑制细胞凋亡。在AD发生发展过程中，由于胰岛素信号通路损伤，PI3K活性降低，引起AKT活性降低以及GSK3β活性升高，导致tau蛋白超磷酸化，并在细胞内聚集为双螺旋丝，最终可造成神经元的死亡和丢失。

本课题组采用的实验动物为APP/PS1双转基因小鼠，该小鼠可在短期内大量产生Aβ42及ADDLs，出现拟AD的病理改变，且随年龄的增加，病理改变逐渐加重，2～3个月出现轴突肿胀，4～5个月出现老年斑，6个月可出现大量淀粉样斑块，是迄今为止公认的较为理想的AD动物模型[11]。广泛的证据表明，中药单体姜黄素可以通过抗氧化、抗炎、抑制蛋白聚积、抗细胞凋亡、改善脑内胰岛素信号途径等对神经变性病起到神经保护作用。课题组前期研究发現，姜黄素可对损伤的胰岛素信号通路中降低的InR，IRS以及胰岛素生长因子（insulinlike growth factors， IGFs）等起到恢复作用（待发表），课题组针对胰岛素信号途径中下游的关键蛋白PI3K及其活化形式pPI3K进行了进一步研究发现，模型组与对照组相比，PI3K与pPI3K的阳性细胞数明显减少，平均灰度值明显增加，染色明显变浅，蛋白条带明显变细，表明PI3K与pPI3K在AD状态下存在明显的损伤。与模型组小鼠相比，各治疗组小鼠海马PI3K与pPI3K出现不同程度的阳性细胞数增加，平均灰度值减低，染色变深，蛋白条带增粗、变深，以罗格列酮组与姜黄素中剂量组变化最为显著，姜黄素可以使APP/PS1双转基因小鼠已受损下调的PI3K和pPI3K阳性细胞数与蛋白表达在一定程度上有所恢复，且中等剂量应用时效果为最佳，说明姜黄素可能通过调节胰岛素信号通路的PI3K途径而对AD进行神经保护。

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Effects of curcumin on expression of PI3K and pPI3K in

hippocampus of AD mice

DANG Huizi1，2， LI Ruisheng3， WANG Hong4， REN Ying1，2， SUN Haiyun1，2，

YANG Jinduo1，2， WANG Pengwen1，2 *

（1.Key Laboratory of Pharmacology of Dongzhimen Hospital， Beijing University of Chinese Medicine，

State Administration of Traditional Chinese Medicine， Beijing 100700， China；

2.Key Laboratory of Chinese Internal Medicine of Ministry of Education and Beijing， Dongzhimen Hospital，

Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100700， China；

3.The Second Hospital Affiliated to Xinjiang Medical University， Urumqi 830028， China；

4.Amcare Women and Children′s Hospital， Beijing 100016， China）

[Abstract] Objective： To observe the effect of curcumin on the expression of PI3K （phosphatidylinositol3kinase， PI3K） and pPI3K （phosphated phosphatidylinositol3kinase， pPI3K） in the hippocampus of Alzheimer′s disease （AD） model （APP/PS1 double transgenic） mice. Method： A total of 60 threemonthold APP/PS1 double transgenic mice were randomly divided into model group， rosiglitazone group （10 mg·kg-1·d-1） and curcumin large（400 mg·kg-1·d-1）， medium（200 mg·kg-1·d-1） and small（100 mg·kg-1·d-1） dose group. Twelve C57BL/6J mice in the same age and genetic background as APP/PS1 double transgenic mice were used as normal control group. All the 6 groups of mice were intragastrically administered for 3 months. After 3 months， the expression of PI3K and pPI3K were detected by immunohistochemistry and Western blot. Result： The expression of PI3K and pPI3K positive cells in hippocampus CA1 region significantly decreased in model group compared with normal control group （P<0.05）， while compared with model group， PI3K and pPI3K positive cells of all the curcumin intervention groups increased to varying degrees in hippocampus CA1 region，especially the middle dose group（P<0.01）. Besides，Western blot results of the curcumin high dose group were also increased obviously （P<0.05）. Conclusion： Curcumin can recover the decreased PI3K and pPI3K and improve the insulinsignaling transmission in the hippocampus of APP/PS1 double transgenic mice. The mechanism of curcumin maybe by regulating the insulin signal transduction to treat AD.

[Key words] curcumin； APP/PS1 double transgenic mice； PI3K； pPI3K

doi：10.4268/cjcmm20130906

[責任编辑 张宁宁]