黑曲霉粗酶液对苦杏仁苷的生物转化研究
时间：2021-04-23 08:03:31 来源：达达文档网 本文已影响 人 
摘要：为筛选到新型具有抗肿瘤活性转化产物，采用酶催化转化的方法对苦杏仁苷进行了生物转化研究。ＨＰＬＣ分析表明，苦杏仁苷在黑曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）全细胞酶的作用下生成了４个产物，并采用ＭＳ和ＮＭＲ法对产物的结构进行了鉴定。
关键词：黑曲霉；苦杏仁苷；生物转化；结构鉴定
中图分类号：Ｏ６５５．４；Ｑ５５６＋．２ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０12）02－0377-03
Ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｔｈｅ Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｍｙｇｄａｌｉｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Cｒｕｄｅ Eｎｚｙｍｅ Eｘｔｒａｃｔ ｆｒｏｍ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ
ＣＨＡＮＧ Ｊｕｎ
（Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｊｉａｎｇｘｉ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｎａｎｃｈａｎｇ ３３００１３， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｏ ｓｃｒｅｅｎ ｓｏｍｅ ｎｅｗ ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ ｆｒｏｍ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｓ ｏｆ ａｍｙｇｄａｌｉｎ， ａｍｙｇｄａｌｉｎ ｗａｓ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｒｕｄｅ ｅｎｚｙｍｅ ｅｘｔｒａｃｔ ｆｒｏｍ Ａｓｐｇｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ． Ｔｈｅ ＨＰＬＣ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ａｍｙｇｄａｌｉｎ ｗａｓ ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｄ ｉｎｔｏ ｆｏｕｒ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｗｅｒｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｗｉｔｈ ＭＳ ａｎｄ ＮＭＲ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ； ａｍｙｇｄａｌｉｎ； ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ； ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
苦杏仁苷（Ａｍｙｇｄａｌｉｎ）属苯乙醇腈的β－龙胆二糖苷，是苦杏仁中的主要有效成分之一，其结构见图１。苦杏仁苷广泛存在于杏、桃、李等多种蔷薇科植物果实的种子中，具有良好的抗肿瘤［１］、抗氧化［２］、调节免疫功能［３］及镇咳平喘的作用［４］。研究表明，由于苦杏仁苷在微生物、葡萄糖苷酶、酸或碱作用下水解产生的氢氰酸［５］可通过抑制线粒体电子传递链的终端酶——细胞色素氧化酶中断ＡＴＰ的合成，导致肿瘤细胞死亡［６］，但另一方面，苦杏仁苷中的糖苷键在微生物发酵液、酸或碱性条件下极易降解为氢氰酸和苯甲醇，难以控制，所以通过黑曲霉粗酶液对苦杏仁苷进行了催化转化，以期找到具有抗癌活性的新物质。
１ 材料与方法
１．１ 材料
苦杏仁苷由苦杏仁中分离纯化得到，纯度＞８５％，杏仁腈、苯由酸、野樱苷均购自Ｓｉｇｍａ公司，纯度＞９８％。色谱纯甲醇购于Ｆｉｓｈｅｒ公司，其他均为分析纯试剂。
１．２ 微生物菌株
黑曲霉为笔者所在实验室保藏菌株，分离于土壤，４ ℃保存于ＰＤＡ斜面上，每两月转接１次保持其活力。
１．３ 黑曲霉粗酶制备
黑曲霉液体培养基含８ ｇ／Ｌ葡萄糖，５ ｇ／Ｌ蛋白胨，５ ｇ／Ｌ酵母膏， ５ ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４， ５ ｇ／Ｌ ＮａＣｌ， １ ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４ ·７Ｈ２Ｏ，１ ｇ／Ｌ ＭｎＳＯ４·４Ｈ２Ｏ，ｐＨ ６．５。黑曲霉孢子（１０７个／ｍＬ）接入无菌培养基后，置于２８ ℃，１６０ ｒ／ｍｉｎ振摇培养５ ｄ。收集发酵液，过滤，弃去菌丝体，上清液用饱和硫酸铵４ ℃下盐析１２ ｈ，以１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ、４℃离心３０ ｍｉｎ，取沉淀。沉淀用少量去离子水溶解，脱盐，冷冻干燥得粗酶，４ ℃冰箱保存备用。
１．4 苦杏仁苷催化转化
取０．５ ｍＬ的１０ ｍｇ／ｍＬ苦杏仁苷溶液于２ ｍＬ的８２ Ｕ／ｍＬ（以β－葡萄糖苷酶活性计）的粗酶水溶液中，３７ ℃保温反应４ ｈ。
１．5 ＨＰＬＣ分析
安捷伦１１００液相色谱系统，Ｃ１８反相色谱柱（２５０ ｍｍ × ４．６ ｍｍ），柱温２８ ℃，流动相为体积分数为３０％的甲醇－水溶液，检测波长２１０ ｎｍ，进样量１０ μＬ。对照品配制成浓度为２ ｍｇ／ｍＬ，其他检测条件相同。
１．6 酶解产物的分离和纯化
反应完成后，先用等体积石油醚萃取酶解液３次，再用等体积氯仿萃取３次，收集氯仿萃取液，浓缩干燥，残留物用甲醇溶解，再依次用大孔树脂和硅胶柱进一步纯化，大孔树脂的洗脱液为氯仿－甲醇溶液，按照体积比１∶９～９∶１进行梯度洗脱，硅胶柱的洗脱液为甲醇－水溶液，按照体积比２∶８～６∶４进行梯度洗脱，收集组分后，冷冻干燥备用。
２ 结果与分析
２．１ 催化转化结果
图２为各种样品的ＨＰＬＣ图谱。对比图２-Ａ、图２-Ｂ和图２-Ｃ可知，酶解反应４ ｈ后，在５．０８７ ｍｉｎ处没有苦杏仁苷峰（图２-Ｂ），这表明，苦杏仁苷发生了水解，而且在图２-Ｂ中还出现了４个新峰，说明苦杏仁苷经水解后，产生了４个转化产物。经过与杏仁腈、苯甲酸、野樱苷标准品ＨＰＬＣ（谱图未列出）对比，发现产物１、３、４分别与杏仁腈、野樱苷和苯甲酸保留时间相同，因此可初步判断产物１、３、４分别为杏仁腈、野樱苷和苯甲酸。
２．２ 产物分离纯化结果
发酵液经氯仿萃取后，产物２主要存在于氯仿层中，上层水溶液中仅有少量产物２。将氯仿层合并、旋转蒸发浓缩，大孔树脂洗脱，分析表明，产物２主要集中在氯仿－甲醇体积比为３∶７的洗脱组分中。收集该洗脱液，浓缩，并用硅胶柱洗脱，浓缩、干燥，产物２的纯度达到９８％。该物质的理化鉴定结果如下：白色针状结晶（ＣＨＣｌ３－ＭｅＯＨ），ｍｐ：１３７－１４０℃， ［α］２０Ｄ －３７．０（Ｃ ０．７６，ＣＨ３ＣＯＣＨ３）．ｖｍａｘ： ３ ４７０ ｃｍ－１； ＥＳＩ－ＭＳ ｍ/ｚ：３４１．２９８ ６［Ｍ＋Ｈ］＋， １３Ｃ－ＮＭＲ （ＣＤＣＯＣＤ３，１２５ ＭＨｚ）：δＣ １０６．７（Ｃ－ｌ’），６９．６ （Ｃ－２’），１１８．４（Ｃ－３’），１２５．３（Ｃ－４’），１０８．９（Ｃ－５’）， １５４．４（Ｃ－６’）．１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣＯＣＤ３， ５００ＭＨｚ）：δＨ ６．５７（２Ｈ，ｍ，Ｈ－５，７），７．０５（２Ｈ，ｍ，Ｈ－４，８）；δＨ ５．９１ （１Ｈ，ｓ，Ｈ－２），δＨ ４．３０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ， Ｈ－ｌ’）。经与文献［７］对比后发现，产物２比野樱苷在Ｃ－６上多了1个羟基，其化学结构式见图３。
３ 讨论
苦杏仁苷属苯乙醇腈的β－龙胆二糖苷类化合物，在酸、碱性条件下不稳定。在分离苦杏仁苷的过程中，也会发生少量的降解。现有的苦杏仁苷相关研究主要集中在栽培、分离、毒性［８］及检测［９，１０］等方面。描述苦杏仁苷具有肿瘤活性的报道称，其活性主要由其降解产物氢氰酸对电子传递链的毒性导致肿瘤细胞死亡而实现。然而，也有报道称苦杏仁苷并不具有抗肿瘤效果［１１］。因此，对苦杏仁苷的抗肿瘤活性及其相关机理还需要进一步研究。
本课题组在苦杏仁苷的生物转化研究中发现，黑曲霉发酵液的酸性环境会影响苦杏仁苷的稳定性，为了降低酸性环境对苦杏仁苷的不利影响，应用黑曲霉粗酶提取液对苦杏仁苷进行了催化，结果表明，当排除酸性发酵环境的影响后，苦杏仁苷生成了新的产物６－ＯＨ－野樱苷，其反应机制可能是苦杏仁苷在β－葡萄糖苷酶的作用下水解成苷元（野樱苷），生成的苷元很容易在环境因素或其他酶的作用下进一步降解成杏仁腈和苯甲酸，如果能排除环境因素对苷元稳定性的影响，苷元能够在羟基化酶的作用下进一步羟基化生成６－ＯＨ－野樱苷。６－ＯＨ－野樱苷是一新化合物，其抗肿瘤活性还需要进一步研究。
参考文献：
［１］ ＧＲＩＦＦＩＮ Ｇ Ｅ． Ｗｏｒｌｄ ｗｉｔｈｏｕｔ ｃａｎｃｅｒ： ｔｈｅ ｓｔｏｒｙ ｏｆ ｖｉｔａｍｉｎ Ｂ１７．１［M］． Thousand Oaks：American Media，１９７４.１０３－１０４．
［２］ 董 捷，尹 策，张红城，等． 杏花花粉中苦杏仁苷的抗氧化性研究［Ｊ］． 食品科学， ２０００，２８（８）：６５－６８．
［３］ 方伟蓉，李运曼，钟林霖． 苦杏仁苷对佐剂性炎症影响的实验研究［Ｊ］． 中国临床药理学与治疗学，２００４，９（３）：２８９－２９３．
［４］ 周金黄，王筠默． 中药药理学 ［Ｍ］．上海：上海科学技术出版社，１９８６，２１９．
［５］ ＨＡＩＳＭＡＮ Ｄ Ｒ， ＫＮＩＧＨＴ Ｄ Ｊ．Ｔｈｅ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｍｙｇｄａｌｉｎ ［Ｊ］． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ， １９６７，１０３：５２８－５３４．
［６］ 连彦军，陈道达，黄 韬，等． β－葡萄糖苷酶激活苦杏仁苷诱导ＬｏＶｏ细胞凋亡及活性对Ｂａｘ与ｂｃｌ－２基因表达和Ｃａｓｐａｓｅ－３的影响［Ｊ］． 肿瘤防治杂志，２００５，１２（６）：４１３－４１６．
［７］ ＡＲＩＴＯＭＩ Ｍ， ＫＵＭＯＲ Ｔ， ＫＡＷＡＳＡＫＩ Ｔ． Ｃｙａｎｏｇｅｎｉｃ ｇｌｙｃｏ ｓｉｄｅｓ ｉｎ ｌｅａｖｅｓ ｏｆ Ｐｅｒｉｌｌａ ｆｒｕ ｔｅｓｃｅｎｓ ｖａｒ． ａｃｕｔａ［Ｊ］． Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８５，２４（１０）：２４３８－２４３９．
［８］ ＮＯＵＴ Ｍ Ｊ， ＴＵＮＣＥＬ Ｇ， ＢＲＩＭＥＲ Ｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｄｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｍｙｇｄａｌｉｎ ｏｆ ｂｉｔｔｅｒ ａｐｒｉｃｏｔ ｓｅｅｄｓ （Ｐｒｉｎｕｓ ａｒｍｅｎｉａｃａ） ［Ｊ］． Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９５，２４（３）：４０７－４１２．
［９］ ＲＡＵＷＳ Ａ Ｇ， ＧＲＡＭＢＥＲＧ Ｌ Ｇ， ＯＬＬＩＮＧ Ｍ． Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ａｍｙｇｄａｌｉｎ ａｎｄ ｉｔｓ ｍａｊｏｒ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ ｐｒｕｎａｓｉｎ ｉｎ ｐｌａｓｍａ ａｎｄ ｕｒｉｎｅ ｂｙ ｈｉｇｈ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ［Ｊ］． Ｐｈａｒｍａｃｙ Ｗｏｒｌｄ ＆ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８２，４（６）：１７２－１７５．
［１０］ ＤＵ Ｑ， ＪＥＲＺ Ｇ．， ＨＡ Ｙ． ｅｔ ａｌ． Ｓｅｍｉ－ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓａｌｉｃｉｎ ａｎｄ ａｍｙｇｄａｌｉｎ ｆｒｏｍ ｐｌａｎｔ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｕｓｉｎｇ ｓｌｏｗ ｒｏｔａｒｙ ｃｏｕｎｔｅｒ－ｃｕｒｒｅｎｔ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ， ２００５，１０７４（１－２）：４３－４６．
［１１］ ＭＩＬＡＺＺＯ Ｓ， ＬＥＪＥＵＮＥ Ｓ， ＥＲＮＳＴ Ｅ． Ｌａｅｔｒｉｌｅ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ： ａ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｖｉｄｅｎｃｅ［Ｊ］． Ｓｕｐｐｏｒｔ Ｃａｒｅ Ｃａｎｃｅｒ，２００７， １５（６）：５８３－５９５．
