桂枝附子含药血清对类风湿关节炎模型的影响

摘要：目的 通过液质联用（LC-MS）技术分析桂枝附子温通经脉配伍灌胃后胶原关节炎（CIA）大鼠的血清移行成分，考察桂枝附子含药血清对类风湿关节炎模型的影响。方法 选取雄性Wistar大鼠25只随机取6只分为正常组、桂枝附子组，每组3只，其余大鼠采用Ⅱ型胶原造模。将造模成功的6只CIA大鼠随机平均分为模型组、造模桂枝附子组，每组3只。予20倍给药剂量的桂枝附子配伍灌胃给药，正常组和模型组大鼠予生理盐水灌胃，60 min后经肝门静脉取血，采用甲醇沉淀法处理血清，予LC-MS技术对其进行分析。通过将含药血清与相同条件下测定的模型组血清、正常组血清、供试品以及对照品图谱比较，分析大鼠给药后血清中的移行成分。结果 桂枝附子组含药血清中产生了10个移行成分，均为代谢产物;造模桂枝附子组含药血清产生了25个移行成分，其中8个为原形成分，17个为代谢产物。结论 造模后大鼠的含药血清中移行成分明显增加，成分浓度也较高。由此可见，CIA大鼠病理模型选择性的吸收了桂枝附子含药学清中的成分，从基础层面探讨中医“有是病用是药”理论。

关键词：CIA病理模型;类风湿关节炎;桂枝附子;含药血清;LC-MS

中图分类号：R255.6 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2019）04-0069-05

风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是慢性、侵蚀性、全身性的自身免疫疾病，其基本病理改变为对称性的关节滑膜炎，血管翳形成，并逐渐出现关节软骨和骨质的侵蚀与破坏，最终可导致关节畸形和功能丧失。目前治疗RA的常用药物为非甾体类抗炎药、糖皮质激素类和慢作用抗风湿药等，这些药物的毒副作用较大，而生物制剂则价格昂贵。结合我国几千年中医药治疗风湿病的特色，及云南吴佩衡扶阳学术思想，以温阳通络法治疗风湿病为切入点，开展中医药防治风湿病，对提高人民群众健康水平具有重要的意义。通过临床实践及实验研究发现，温阳通络法对风寒湿痹的临床症状有明显改善，可显著降低CRP、ESR、RF滴度等指标。其中桂枝、附子做为主要药物，具有温经通阳、散寒除湿之功，发挥着蠲痹止痛之效。药物经口服后通过消化道直接吸收入血，或经消化酶及肠内菌群的分解成代谢产物被吸收入血。中药的有效物质最终都会以血液为媒介输送到不同的作用靶点发挥药效。本课题通过液质联用技术（LC-MS）分析桂枝、附子以及桂枝附子温通经脉配伍灌胃后胶原关节炎（CIA）大鼠的血清移行成分，考察含药血清对CIA大鼠模型的影响，建议入血色谱图，进一步探讨桂枝附子配伍灌胃后的入血药效物质基础以及配伍环境的相互作用，从而为桂枝附子温通经脉配伍抗RA提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性Wistar大鼠25只，SPF级，体重（200±20）g;由成都达硕生物科技有限公司提供，实验动物使用许可证号SCXK（川）2013-24。

1.2 实验药材于与试剂 中药材桂枝、附子由云南省中医医院中药房提供。牛Ⅱ型胶原，四川大学;完全弗氏佐剂（263810，BD公司）;苯甲酰新乌头原碱63238-67-5、苯甲酰乌头原碱466-24-0、苯甲酰次乌头原碱63238-66-4、桂皮醛89Z9-G2NP、对甲氧基桂皮酸乙酯XW99-CWBR、肉桂酸VUZS-DKSH，均来自中国药品生物制品检定所;甲醇、乙酸乙酯、乙腈、三氯乙酸、冰醋酸等。

1.3 实验仪器 Waters Xevo TQD三重四极杆液质联用仪，美国Waters公司;Agilent1100 高效液相色谱仪，美国Agilent公司;AL 204万分之一分析天平，瑞士Metter T-oledo公司;Biofuge Primo R 离心机，德国Thermo ScientificHeraeus公司;YLS-7B足趾容积测量仪，济南益延科技发展有限公司。

1.4 醇提浸膏的制备

1.4.1 附子醇提浸膏的制备 取附子药材饮片，打粉过60目筛，精密称定600 g，置圆底烧瓶中，按料液比1：10（g/mL）加入95%乙醇，于超声清洗器中振荡提取50min，浸泡1天，回流提取2h，提取2次，过滤，合并提取液，测定浸膏得率，回收乙醇得浸膏，灭菌后置低温处保存备用[1-2]。

1.4.2 桂枝醇提浸膏的制备 取桂枝药材饮片，打粉过60目筛，精密称定600 g，置圆底烧瓶中，按料液比1：10（g/mL）加入95%乙醇，热回流提取2 h，连续3次，合并滤液，测定浸膏得率，回收乙醇得浸膏，灭菌后置低温处保存备用[3]。

1.5 含药血清和空白血清的制备 选取Wistar大鼠25只，随机选取4只平均分为正常组和桂枝附子组，每组2只，剩下21只造CIA大鼠模型。造模后21天的大鼠采用关节炎分数评分法计算关节炎指数。将造模成功后的4只大鼠随机平均分为模型组和造模桂枝附子组，每组2只。根据云南扶阳流派临床常用生药剂量（桂枝20 g，制附子30 g）的20倍给药，按“人和动物之间按体表面积折算的等效剂量比值表”计算出大鼠等效剂量，即实验组大鼠相当给生药量为90 g·kg-1。桂枝附子组以及造模桂枝附子组予桂枝附子配伍灌胃，正常组和模型組给予等量生理盐水灌胃，给药容积为1 mL/100 g。给药前将大鼠禁食12 h，使大鼠处于空腹状态，以促进药物的吸收。灌胃后60 min于肝门静脉取血0.5 mL，待血液凝固后，置离心机于4 ℃，12000 r，3 min离心后分离血清，同组血清合并，用甲醇沉淀法对血清进行处理。造模评价方法：致炎后第21天采用关节炎分数评分法计算关节炎指数。0级：无红斑或肿胀，0分;I级：轻微的红斑和一个趾关节肿胀，1分;II级：红斑和超过一个趾关节的肿胀，2分;III级：红斑和踝部或腕部肿胀，3分;IV级：全部红斑以及脚趾和踝部或手指和腕部的肿胀，踝或腕不能弯曲，4分;4只肢体关节肿胀级之和（最高分为16分）即为大鼠关节炎指数，大鼠关节炎指数≥2为造模成功的标准。7天/次，共4次。

1.6 供试品的制备 精密称取附子、桂枝浸膏1 g，置100 mL量瓶中，加甲醇适量，超声处理30 min，甲醇定容至刻度，摇匀，即得。

1.7 对照品溶液的制备 分别精密称定桂皮醛对照品、肉桂酸对照品、对甲氧基桂皮酸乙酯对照品、苯甲酰新乌头原碱对照品、苯甲酰乌头原碱对照品、苯甲酰次乌头原碱对照品适量，精密称定，加入甲醇制备成每1 mL含10μg的溶液。

1.8 检测条件

1.8.1 色谱条件 ZORBAX SB-C18（4.6mm×250mm，5μm）色谱柱;水为流动相A，甲醇为流动相B，梯度洗脱程序为甲醇的浓度梯度 1%（0-1.0 min），1.0%-3.0%（1.0-1.5 min），3.0%-32%（1.5-13.5 min），32%-60%（13.5-18.5 min），60%-90%（18.5-20.5 min）进行梯度洗脱;柱温25度，流速5μL/min;测波长分别为242 nm、254 nm、265 nm、290 nm及320 nm。

1.8.2 质谱条件 电喷雾离子源（正负离子扫描）;正离子扫描为3000 V，负离子扫描为2800 V，离子源温度为110 ℃，雾化气流量为150 L/h，脱溶剂气流量为600 L/h，脱溶剂温度为250 ℃，毛细管电压锥孔电压为35 V，微通道板电压为2700 V，碰撞气为氩气，碰撞能为4 V;每0.1s采集一次谱图;亮氨酸-脑啡肽（leucine-enkephalin，[M+H]+=556.2771;[M-H]-=554.2615）溶液校正質量，进样速度为100 μL/min，频率为5 s;采用全扫描方式，扫描范围m/z100～1000Da。

1.9 测定与方法学考察 分别吸取含药血清、空白血清、供试品溶液、对照品溶液各10μL，注入高效液相色谱质谱仪，予液质联用法（LC-MS）对血清进行检测分析。通过记录桂皮醛对照品、肉桂酸对照品、对甲氧基桂皮酸乙酯对照品、苯甲酰新乌头原碱对照品、苯甲酰乌头原碱对照品、苯甲酰次乌头原碱对照品以及空白血清的色谱图，观察相同保留时间处空白血清色谱图中是否检测出对照品的色谱峰。结果显示对照品及大鼠血清内源性物质均实现基线分离，且在对照品色谱峰的“信号窗”（信号附近的有限范围）内没有出现内源性物质信号的干扰。

2 实验结果

通过对比含药血清与正常组空白血清的图谱，筛选出有差异化合物峰，即为桂枝、附子灌胃后血中移行成分;通过对比含药血清中的移行成分与桂枝、附子供试品的图谱，筛选相同的化合物峰，即为被吸收的原型成分，在中药供试品图谱中没有被检测到的化合物峰即为代谢产物[4]。通过分析相关图谱，考察类风湿关节炎造模对中药灌胃后大鼠血清中移行成分的影响。

进样14 min～18 min正离子模式下造模桂枝附子组、桂枝附子组以及正常组的血清质谱图。通过质谱图的对比，在造模桂枝附子组的血清中检测到离子峰m/z409.2与m/z425.2，m/z429.3，m/z452.2。桂枝附子组的血清中检测到离子峰m/z318.3，m/z362.4与m/z384.4。

同理，通过对比0 min～2 min，2 min～6 min，6 min～10 min，10 min～14 min，14 min～18 min以及18 min～22 min的正、负离子模式下造模桂枝附子组、桂枝附子组、正常组的血清以及桂枝、附子供试品相同时段质谱图，结果显示CIA大鼠灌胃桂枝附子配伍后含药血清中产生了25个移行成分，其中8个为中药原形成分，其余17个为代谢产物;正常大鼠灌胃桂枝附子后含药血清中产生了10个移行成分，均为代谢产物。见表1、表2。

3 讨论

中医辨病论治的理论由来已久。《黄帝内经》早有热论、咳论、痿论、痹论、厥论、风论、疟论、癫狂等病名的记载，而“内经十三方”也提及的相应疾病，如生铁落饮治疗狂证，鸡矢醴治疗臌胀，兰草汤治疗脾瘅等等[5]。《诸病源候论》、《神农本草经》、《千金要方》以及《三因极一病证方论》等古籍也有关于辨病论治的阐述。明清时期医家喻嘉言曰：“有是病用是药，病千变，药亦千变”;“故治病必先识病，识病然后议药，药者所以胜病者也。识病，则千百药中，任举一二种用之且通神;不识病，则歧多而用眩。”辨识疾病是治疗疾病的首要任务和方法。近代著名医家岳美中指出“有是病即用是药，故一病有一病之专方……不能辨病，焉能识证，不能用方，焉能施治”，同样强调了辨病论治的重要性。疾病是机体在一定病因作用下，因自稳调节紊乱而发生的异常生命活动过程。由于生理与病理状态下机体对药物的吸收分布不同，随之产生的药效物质成分也不同，而这些差异很大程度上影响中药的药效的发挥。本实验采用血清药化学方法，通过分析比较模型组与非模型组含药血清成分，考察桂枝附子含药学清对CIA大鼠病理模型的影响，探讨中医“有是病用是药”以及“有故无殒，亦无殒”的理论基础。

中药以及中药复方是一个巨大而复杂的系统，其药效的发挥是多种化学成分相互作用产生的综合效果[6]。中药的有效物质最终都会以血液为媒介输送到不同的作用靶点从而发挥药效[7]。20世纪90年代初王喜军教授提出了“中药血清药物化学”理论及研究内容，研究结果不仅揭示中药药效物质基础，也为解析方剂配伍规律、阐释中药药理学特性等中医药研究提供了科学有效的方法。本课题利用CIA大鼠模型模拟人类类风湿关节炎，从药物吸收情况考察桂枝附子含药血清对类风湿关节炎模型的影响，从而验证了中医“有是病用是药”的理论基础。CIA大鼠发病机制主要是由Ⅱ型胶原活化的T细胞和巨噬细胞早期侵入滑膜内层，局部释放炎性因子，随着粒细胞等侵入，共同形成血管翳[8]。破骨细胞和胶原酶的介入最终导致骨结构的丧失，自愈再发的反复过程中新生骨的形成，致使关节变形和僵硬。CIA大鼠膝、踝关节可见明显的滑膜细胞增生、毛细血管增生以及炎细胞浸润与关节软骨面剥脱，这些表现接近人类的类风湿关节炎[9]。相关报道显示殷飞等通过观察正常大鼠、病理状态的大鼠清肝化瘀方药含药血清对人肝癌细胞增殖和凋亡的影响，结果显示病理状态下大鼠的血清对肝癌细胞有明显的抑制作用[10]。吕涛等用40%CCl4皮下注射9周制备大鼠肝纤维化模型，运用HPLC检测正常、肝纤维化大鼠分别灌服黄芪后血清中的黄芪甲苷含量，结果病理大鼠含药血清中的黄芪甲苷含量高于正常大鼠含药血清[11]。由此可见，病理状态下的机体对药物的吸收有促进作用。正常生理状态下的动物血清能在一定程度上避免疾病机体对体内药物有效成分的“消耗”，从而导致正[FQ（21*1。175mm，X，DY-W]常动物血清中的有效成分与病理状态的有所差异[12]。由于生理与病理状态下机体对药物的吸收转化不同，产生的内源性活性成分及其浓度也有所不同。本实验结果显示CIA大鼠的含药血清产生了25个移行成分，其中8个为原形成分，17个为代谢产物;而未造模大鼠含药血清只产生10个移行成分，CIA大鼠的含药血清浓度也较未造模的高。由此可见类风湿关节炎模型促进了桂枝附子配伍有效成分的吸收。故病理状态下制备的中药含药血清更有利于中药药效的发挥，其结果也更加真实、可靠。这也从基础层面验证了中医“有是病用是药”的理论，这不仅为中医药现代化、国际化提供了一定的途径，也而为更好的指导临床提供了理论基础。

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