基于UPLC—Q—TOF—MS技术的芩百清肺浓缩丸血清药物化学初步研究

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[摘要]应用UPLC-Q-TOF-MS技术和血清药物化学理论分析检测芩百清肺浓缩丸的入血成分。灌胃给予大鼠芩百清肺浓缩丸溶液后，肝门静脉采血，血清经SPE处理，采用ACQUITY UPLC BEH C₁₈色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），0.1%甲酸水（A） -0.1%甲酸乙腈（B）流动相系统进行梯度洗脱，流速0.3 mL·min^-1，柱温35 ℃。通过对比分析体外样品、空白血清及含药血清，同时结合Peakview和Metabolitepilot软件鉴定和表征其血中移行成分，在给药后的大鼠血清中分析鉴定了28个血中移行成分，其中18个原型成分，10个代谢产物。应用UPLC-Q-TOF-MS技术和血清药物化学理论较为全面地阐明了芩百清肺浓缩丸在大鼠血清中的移行成分，为进一步研究其体内代谢过程以及药效物质基础提供了科学依据。

[关键词]芩百清肺浓缩丸； 血清药物化学； 血中移行成分； UPLC-Q-TOF-MS

[Abstract]To analyze the main components of Qinbai Qingfei concentrated pellets in rat serum with UPLC-Q-TOF-MS technology and serum pharmacochemistry theory. After gavage administration with Qinbai Qingfei concentrated pellets， blood was collected from hepatic portal vein. ACQUITY UPLC BEH C₁₈（2.1 mm×100 mm， 1.7 μm） was used， with 0.1% formic acid agueous solution（A）-0.1%formic acid and acetonitrile（B） as the mobile phase for gradient elution. The flow rate was 0.3 mL·min^-1， the column temperature was maintained at 35 ℃. Through the comparative analysis fingerprints of Qinbai Qingfei concentrated pellets， drug containing-serum and blank serum， and with the help Peakview and Metabolitepilot software， components in serum were defined. A total of 28 compounds were identified， including 18 prototypes and 10 metabolites. As a result， UPLC-Q-TOF-MS technology and serum pharmacochemistry theory were applied to comprehensively expound Qinbai Qingfei concentrated pellets′constituents migrating to rat serum， and provide scientific basis for further studies for in vivo metabolic process and effective material base.

[Key words]Qinbai Qingfei concentrated pellets； serum pharmacochemistry； constituents migrating to serum； UPLC-Q-TOF-MS

中藥血清药物化学是以传统药物化学方法为基础，综合应用多种现代技术，分析鉴定口服中药后血清中移行成分，研究其与药效相关性，确定中药药效物质基础的应用学科^[1]。此方法自提出以来已经被成功应用于多种中药以及中药复方的研究^[2-3]，研究结果不仅揭示中药药效物质基础，而且为解析方剂配伍规律、阐释中药药理学特性及创新药物设计等中医药关键科学问题提供了科学有效的方法。

芩百清肺浓缩丸（以下简称芩百，发明专利证书号ZL03102049.6），是国家食品药品监督管理总局批准的第一个用于临床观察治疗小儿支原体肺炎的中药制剂，由黄芩、百部、紫菀、桔梗、麦冬、地龙6味中药组成，具有清热解毒、降气平喘、润肺止咳之功效，适用于儿童支原体肺炎的治疗。前期实验表明，其能提高免疫功能和促进气道上皮细胞的修复，能有效减轻支原体对肺部组织的炎性病变，促进上皮细胞的恢复^[4-6]。然而芩百的药效物质基础尚未完全阐明，本文利用血清药物化学方法以及UPLC-Q-TOF-MS技术进一步研究芩百的血中移行成分，旨在揭示其药效物质基础。

1 材料

Waters ACQUITYTM UPLC液相色谱仪（Waters，USA）；AB Sciex 5600+型质谱仪（Sciex，USA）；Analyst TF 1.6工作站（Sciex，USA）；PeakView 2.0软件（Sciex，USA）；Metabolitepilot 1.5 软件（Sciex，USA）；IKA MS3 digital涡旋振荡器（广州仪科实验室技术有限公司，中国）；MTN-2800W氮吹浓缩装置（天津奥特赛恩斯仪器有限公司，中国）；RAININ E4 XLS自动单道移液器[规格：0.1～1 mL，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司，中国]；SBP100-200手动单道移液器[规格：20～200 μL，赛比奥科技（广州）有限公司，中国]； AccuBOND ODS-C₁₈固相萃取小柱（规格100 g· L^-1，Agilent，USA）。

芩百清肺浓缩丸（黑龙江中医药科学院制剂室提供，批号20150401，规格3 g/袋）；黄芩（Scutellariae Radix，批号20141201，产地内蒙古）；蜜百部（Stemonae Radix，批号20141101，产地东北）；蜜紫菀（Asteris Radix et Rhizoma，批号20141201，产地河北）；桔梗（Platycodonis Radix，批号20141201，产地河北）；麦冬（Ophiopogonis Radix，批号20141201，产地四川）；地龙（Pheretima，批号20141201，产地河北），所有饮片购自北京同仁堂哈尔滨药店，各药材均由黑龙江省中医药科学院王伟明研究员鉴定为正品。甲醇和乙腈（色谱级，Merck公司）；甲酸（色谱级，Fisher公司）；蒸馏水（广州屈臣氏食品饮料有限公司）。

健康SD雄性大鼠，体重（300±20） g，SPF级，许可证号SCXK（京）2012-0001，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。

2 方法

2.1 芩百水煎液以及冻干粉制备

取单味药适量，按芩百清肺浓缩丸制备工艺提取，制成冻干粉。

2.2 供试品溶液制备

取芩百清肺浓缩丸冻干粉末1 g（过40目筛），精密称定，加入30 mL 75%甲醇，超声30 min，13 000 r·min^-1离心10 min，取上清液，即得。

2.3 体内分析样品的制备

取SD大鼠，禁食12 h（自由饮水），给药组按照23.085 g·kg^-1灌胃给予芩百冻干粉灌胃液，空白组按照20 mL·kg^-1灌胃给予蒸馏水。给药1 h后，腹腔注射10%水合氯醛进行麻醉，肝门静脉取血，3 000 r·min^-1离心10 min，取上清液，-80 ℃冻存备用。

取大鼠空白血清及给药血清各400 μL，各加10 μL磷酸，涡旋震荡60 s，分别上样到预先以2 mL甲醇、2 mL水活化平衡的SPE柱上，以2 mL水淋洗，淋洗液弃去，再以2 mL甲醇洗脱，收集洗脱液，氮气吹干，残渣用200 μL甲醇复溶，涡旋震荡60 s后，4 ℃，13 000 r·min^-1离心10 min，取上清液，进样2 μL供UPLC-Q-TOF-MS分析。

2.4 分析条件

2.4.1 质谱条件 离子化模式为电喷雾正、负离子模式，正负离子源电压分别为5 500，-4 500 V，离子源温度为550 ℃，雾化气体为N₂，雾化气（Gas1）为55 psi（1 psi=6.895 kPa），辅助气（Gas2）为55 psi，气帘气（curtain gas）为35 psi，裂解电压（DP）分别为80，-80 V，碰撞能量（CE）分别为35，-35 eV，碰撞能量扩展（CES）均为15 eV。TOF-MS扫描范围为100～1 500，IDA设置响应值超过100 cps的8个最高峰进行二级质谱扫描，Product Ion扫描范围为50～1 500，开启动态背景扣除（DBS）。数据采集所用软件为Analyst TF 1.6 software，数据处理软件为Peakview 2.0/Masterview 1.0 software。

2.4.2 色谱条件 Waters ACQUITYTM UPLC液相色谱仪；ACQUITYTM BEH C₁₈色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；预柱ACQUITYTM UPLC BEH C₁₈保护柱（2.1 mm×5 mm，1.7 μm）；柱温35 ℃；流动相0.1%甲酸水（A）-0.1%甲酸乙腈（B），梯度洗脱，0～4 min，95%～73%A，4～5 min，73%A，5～10 min，73%～50%A，10～13 min，50%～30% A，13～14 min，30%A，14～20 min，30%～0%A，流速0.3 mL·min^-1；样品仓温度4 ℃；进样量2 μL；色谱仪流出液不分流直接进行正负离子扫描检测。

2.5 数据分析方法

利用Peakview软件通过对比给药后血清和空白血清的质谱图，扣除血清中的内源性成分，将剩余离子峰与体外药材提取液离子峰的保留时间，质荷比及二级质谱图进行对比，如果一致则确认为芩百清肺浓缩丸中的原型成分；利用MetabolitePilot数据处理软件，将空白血清及给药血清样品导入，建立Compound library，设置Biotransformation parameters，选择Ⅰ和Ⅱ相代谢途径，根据软件数据结果和参考文献资料推测其代谢产物。

3 结果

3.1 UPLC-Q-TOF-MS色谱图的采集

根据建立的芩百血中移行成分分析方法，在正、负离子模式下采集以上样品的色谱图，见图1。

3.2 血中移行成分鉴定

本课题组前期已经应用UPLC-Q-TOF-MS技术对芩百的化学成分进行了分析，在分析过程中根据精确相对分子质量、同位素丰度比、分子碎片峰，参考相关文献、对照品色谱保留时间及二级谱图，共推断了78个化合物，其中14个来自黄芩，29个来自百部，10个来自麦冬，13個来自紫菀，3个来自桔梗，9个来自地龙^[7]。本试验在此基础上根据2.5项下方法，结合以往文献报道^[8-14]，鉴定了大鼠口服芩百后的28个血中移行成分，其中18个为原型成分，10个为代谢产物，并对其来源进行了归属，结果见表1。

3.3 主要色谱峰的质谱分析

3.3.1 原型成分 试验共鉴定和表征出18个原型成分，分别以化合物3，13为例说明推测过程。化合物3：正离子模式下，其在含药血清总离子图与芩百样品总离子流图中金刚大碱的保留时间基本一致^[7]，二级质谱碎片一致，准分子离子峰m/z 322[M+H]⁺相对丰度较强，拥有共同二级碎片m/z 248，230，174等，故推测其结构为金刚大碱，二级质谱图见图2，可能的裂解途径见图3。

化合物13：正离子模式下，其与芩百样品总离子流图中亚油酸的保留时间基本一致，二级质谱碎片一致，准分子离子峰m/z 281[M+H]⁺相对丰度较弱，拥有共同二级碎片m/z 263，245，133等，故推測其结构为亚油酸，二级质谱图见图4，可能的裂解途径见图5。

3.3.2 代谢产物 根据2.5项下方法结合MetabolitePilot代谢物数据处理软件给出的代谢物最优化峰匹配，最终推测10个代谢产物，以黄芩苷甲基化产物和甲基麦冬黄烷酮B氧化产物为例说明鉴定过程。

黄芩中黄芩苷的代谢较为简单^[15]，其7位上葡萄糖醛酸基可脱去，也可重新结合至6位或7位，因此在体内代谢时间较长，另外 B环的苯环性质也比较活泼，可发生甲基化、羟基化等Ⅰ相反应。代谢物正离子模式下，准分子离子峰m/z 461[M+H]⁺，比黄芩苷准分子离子峰m/z 447[M+H]⁺多14，提示增加1个CH₂，发生甲基化，结合其特征碎片m/z 385，270，与黄芩苷二级碎片比较，符合其甲基化过程，结合文献报道黄芩苷甲基化产物代谢位点可能在B环的4号位。代谢产物匹配度见图6，可能的裂解途径见图7。

麦冬中的高异黄酮是黄酮中特殊的一类，其母体结构仅比异黄酮多1个碳原子。但是其裂解方式与黄酮有明显区别。麦冬中黄酮类化合物B环变化产生的代谢产物较多^[16-17]，尤其是B环有羟基取代的化合物，代谢位点多发生在B环上。

代谢物在负离子模式下，准分子离子峰m/z 343[M-H]-，比甲基麦冬黄烷酮B准分子离子峰m/z 327 [M-H]-多16，提示增加1个O，发生氧化反应，结合碎片m/z 175，167，152，137等，与甲基麦冬黄烷酮B二级碎片比较，符合其氧化过程，结合文献报道甲基麦冬黄烷酮B氧化产物代谢位点可能在B环的3号位。代谢产物匹配度见图8，可能的裂解途径见图9。

4 讨论

试验中在灌胃给予大鼠芩百后，分别在15，30 min，1，2，4，8 h于肝门静脉采血。通过对含药血清色谱图峰强度、峰数目及共有入血成分的峰含量对比分析，确定给药后1 h为最佳采血时间点。血清处理时考察了有机溶剂沉淀（甲醇，乙腈）以及固相萃取（SPE）等多种方法，结果有机溶剂沉淀后样品色谱图的背景较高，而SPE方法处理后的色谱图背景较低，故选用SPE方法处理。试验中血清处理时还考察了是否加磷酸，结果表明血清处理加入10 μL磷酸后，所得到的移行成分更多，且响应值有明显提高。

本试验并没有检测到来自桔梗的入血成分，可能是由于目前文献中报道的桔梗成分大多数为皂苷类成分，其结构不稳定，易发生源内裂解，测定该类化合物时需要的DP及CE较其他类成分低，为了检测到其他大部分化合物，DP设为80，-80 V，CE设为35，-35 eV，CES设为15 eV。推测这可能是桔梗类成分检测不到的重要因素，尚需开展针对桔梗类成分的深入研究。

在大鼠灌胃芩百溶液后的含药血清中共鉴定出18个原型成分，其中来自百部的多为生物碱类成分，生物碱具有镇咳平喘的作用，能延长小鼠浓氨水引咳的潜伏期，减少咳嗽次数，增加大鼠毛细管排痰量，尤其是叶百部碱，它对豚鼠腹腔给药枸橼酸后引起的咳嗽具有剂量依赖性抑制作用^[18]。黄芩的主要成分是黄酮及其苷类，其具有解热抗炎，抗微生物的药理作用。其中黄芩苷和黄芩素能够通过干扰花生四烯酸的代谢通路、抑制细胞因子的活性等产生解热抗炎作用^[19]。黄芩苷更是有直接诱杀支原体的作用，其对支原体的MIC为0.97～3.90 g·L^-1[20]。地龙有止咳平喘的作用，研究表明，地龙能显著减弱哮喘小鼠炎性反应，尤其能抑制嗜酸性粒细胞的增加和浸润，并可抑制或逆转胶原蛋白沉积以及气道黏液的高分泌，从而减缓或抑制哮喘气道重组的进程，并可改善哮喘小鼠的生活质量及生存状态，达到治疗哮喘的目的^[21]。而不饱和脂肪酸类成分等更是具有调节免疫系统，增强免疫功能的作用。结合各味药药理活性相关报道和传统功效，初步推断入血的28种成分可能为其体内发挥作用的药效物质基础，有待进一步研究。

本试验应用UPLC-Q-TOF-MS技术通过比较分析芩百体外提取液与扣除空白血清内源性成分后的含药血清，初步推测出28个入血成分，包括18个原型成分，10个代谢产物。结果表明该方法简便、准确，为芩百药效物质基础的进一步研究奠定了基础。

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[责任编辑 曹阳阳]