姜黄素对APP/PS1双转基因小鼠海马IRS1和pIRS1表达的影响

打开文本图片集

[摘要] 目的：观察姜黄素对AD模型APP/PS1双转基因小鼠胰岛素受体底物1（insulin receptor substrate1，IRS1）和磷酸化胰岛素受体底物1（pIRS1）表达的影响。方法：将3月龄的APP/PS1双转基因小鼠随机分为模型组、阳性对照罗格列酮组（10 mg·kg-1·d-1）、姜黄素高、中、低剂量组（400，200，100 mg·kg-1·d-1），正常对照组为相同背景非转基因小鼠。灌胃3个月后，应用免疫组织化学、Western blot和RTPCR方法进行检测。结果：IRS1和pIRS1免疫组化染色，模型组小鼠大脑海马CA1区IRS1阳性细胞较对照组明显增加（P<0.01），pIRS1明显减少（P<0.01）；与模型组相比，姜黄素各干预组可减少IRS1阳性细胞数（P<0.05或P<0.01），并升高pIRS1阳性细胞数（P<0.05或P<0.01）。Western blot检测海马IRS1和pIRS1的蛋白表达结果与免疫组织化学检测结果一致。RTPCR检测IRS1 mRNA表达结果与免疫组织化学和Western blot结果相反。结论：姜黄素可以使APP/PS1双转基因小鼠海马增加的IRS1和减少的pIRS1得以恢复，并增加IRS1 mRNA表达，改善APP/PS1双转基因小鼠胰岛素信号转导，提示姜黄素可能通过调节胰岛素信号转导机制发挥抗AD作用。

[关键词] 姜黄素；APP/PS1双转基因小鼠；胰岛素受体；胰岛素样受体底物

[稿件编号] 20120806008

[基金项目] 国家自然科学基金面上项目（81073076）；教育部高等学校创新团队项目（IRT0810）

[通信作者] *王蓬文，博士，教授，博士生导师，主要从事神经变性病的中医药防治，Tel：（010）84013195，Email： pw_wang@163.com

[作者简介] 冯慧利，硕士研究生，Tel：（010）84013195，Email：fenghuili1213@163.com

胰岛素是机体生长、发育和维持正常生理活动所必需的一种多功能激素，通过信号转导发挥作用，近些年来胰岛素在中枢神经系统（central nervous system， CNS）的作用备受关注。研究发现，外周胰岛素能通过血脑屏障进入脑内，脑组织某些神经元也能产生胰岛素及表达胰岛素信号转导蛋白[1]。胰岛素和胰岛素样生长因子（insulinlike growth factors， IGFs）除调节神经元存活、能量代谢和神经元的可塑性之外，还控制神经递质的释放，作用于突触、启动与学习和长时记忆有关的信号通路，并作为一种神经营养因子与其他神经营养因子共同形成信号转导网络、维持神经元存活和发挥正常功能，是治疗阿尔茨海默病（Alzheimer′s disease， AD）的潜在靶标。胰岛素的功能发挥必须通过其受体和胰岛素受体底物（insulin receptor substrate， IRS）将信号经多层次不同的信号转导通路来完成。

有文献报道，姜黄素可以结合胰岛素信号转导通路相关蛋白（Akt，MAPK等），并对多种激酶起作用，提示其可能通过参与改善胰岛素信号转导发挥神经保护作用[2]，而胰岛素信号转导通路的主要蛋白通过磷酸化和去磷酸化修饰改变活性，因此检测胰岛素信号转导通路的主要蛋白IRS及其磷酸化形式的水平，对寻找AD的分子标记和药物靶标至关重要。

1 材料

1.1 试剂 姜黄素为美国Sigmaadrich公司产品，批号为c1386；马来酸罗格列酮片为葛兰素史克（天津）有限公司产品，批号为09060108。一抗兔抗小鼠IRS1，pIRS1（免疫组化1∶50，Westernblot 1∶500）抗体购自Abcam公司。SABC免疫组化染色试剂盒、DAB显色试剂盒为武汉博士德生物工程有限公司产品。Western blot常规试剂RIPA组织/细胞裂解液、SDSPAGE凝胶配制试剂盒、Tris base、十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）、脱脂奶粉、过硫酸胺（ammonium persulfate，APS）、甘氨酸为北京环亚泰克生物医学技术有限公司产品。ECL超敏底物化学发光检测试剂盒为尚柏生物医学技术（北京）有限公司产品。PVDF膜为MILLIPORE公司产品。RTPCR常规试剂Trizol试剂盒购自Invitrogen公司，PCR引物由北京博迈德科技发展有限公司提供，AMV反转录试剂盒购自Takara公司，Realtime PCR扩增试剂盒购自北京泽平生物技术有限公司。

1.2 仪器 MiniPROTEAN 3电泳仪购自BIORAD公司。核酸紫外分光光度计 Biophotometer（德国）。

1.3 动物 3月龄APP/PS1双转基因小鼠60只，同背景C57BL/6J小鼠12只，购自中国医学科学院动物研究所，许可证号SCXK（京）20090004，饲养于北京中医药大学东直门医院中药药理学实验室屏障环境动物室[SYXK（京）20042009]。实验过程中动物自由摄食和饮水。

2 方法

2.1 分组和给药 根据SPSS 15.0统计软件产生随机数字随机将AD模型动物APP/PS1双转基因小鼠分为5组，模型组、罗格列酮组（10 mg·kg-1·d-1）、姜黄素高、中、低剂量组（400，200，100 mg·kg-1·d-1），每组12只，于3月龄对小鼠分别实施灌胃治疗，每日1次，连续灌胃3个月。正常对照组为同月龄同背景非转基因小鼠。模型组和对照组给予等体积0.5%羧甲基纤维素钠（sodium carboxymethyl cellulose， CMC）灌胃。

2.2 取材及标本制备 在末次行为学测试后，部分小鼠快速断头处死，剥离海马，分别置于EP管中，于-180 ℃液氮罐中储存备用，每组各6只，左右海马。部分小鼠以多聚甲醛心脏灌注，石蜡包埋、切片。每只小鼠脑于海马CA1区出现后连续冠状切片，片厚4 μm。每组各6只。

2.3 免疫组织化学检测及分析 按说明书进行免疫组化染色。每只选取5张脑片，在20倍物镜下，记数海马CA1区内染色阳性神经元数目；并以Imagepro Plus图象分析系统采集图像和分析，记录每组图像阳性细胞数。

2.4 Western blot检测 蛋白质提取、蛋白质电泳、转膜、封闭、抗原抗体反应，膜的蛋白面朝上，置于洁净保鲜膜上。用吸管将配制的发光检测液转移到蛋白膜上，使其均匀覆盖，室温孵育1～2 min。赶出其间的气泡，固定在X线片暗盒内。在暗室中取一张X线片置于包裹的膜上，合上暗盒，曝光30 s至1 min。立即显影定影，根据其曝光强度，缩短或延长下一张X线片的曝光时间。Western blot胶片经Hp Scanjet G4050扫描成TIF格式图片，用quantity one分析软件对各组条带进行分析，将各组的整合灰度比例与内参（βactin）比较，并以βactin的ID为100%，得到相对百分数，即（ID/内参ID）×100%。

2.5 RTPCR检测 自液氮贮存罐中转移出组织块，置入经冰预冷的研钵中。按0.1 g∶1 mL比例加入Trizol溶液，迅速研磨，将粉末加入无菌的1.5 mL离心管中按说明提取。核酸紫外分光光度计测定经稀释的RNA提取物的A值和浓度、RNA的体外反转与Realtime PCR。

2.6 统计学分析 所得数据以±s表示，采用统计软件SPSS 15.0进行统计分析，组间数据比较用单因素方差分析（OneWay ANOVA）。以P<0.05为差异有显著性意义。

3 结果

3.1 免疫组化法检测海马CA1区神经元IRS1和pIRS1的表达 海马IRS1免疫组织化学染色，阳性细胞的棕黄色颗粒主要分布在胞浆和胞膜。对照组海马阳性神经元分布稀疏，染色较淡，主要分布在胞膜。模型组海马有大量阳性神经元分布，细胞胞体染色深，阳性细胞数量较对照组小鼠阳性细胞表达明显增加，与模型组小鼠相比，罗格列酮组和姜黄素治疗各组小鼠IRS1阳性细胞计数表达明显减少，分布较稀疏，染色较淡（P<0.01或P<0.05），而活化后功能性pIRS1陽性细胞计数模型组较对照组小鼠阳性细胞表达明显减少，分布稀疏，染色较淡。各干预组pIRS1阳性细胞表达明显增加，细胞胞体染色深（P<0.01）（图1，2，表1）。

3.2 Western blot检测APP/PS1双转基因小鼠海马IRS1和pIRS1的表达 模型组小鼠海马IRS1的蛋白表达条带均比对照组小鼠明显增粗、颜色加深，表明其IRS1蛋白表达增加（P<0.01）；与模型组小鼠相比，各干预组小鼠海马IRS1的蛋白表达条带均明显变细、颜色浅（P<0.05或P<0.01），表明增高的蛋白表达有所恢复，而pIRS1的表达结果与IRS1蛋白表达结果相反（图3，4）。

a.对照组；b.模型组；c.罗格列酮组；d.姜黄素高剂量组；e.姜黄素中剂量组；f.姜黄素低剂量组（图2～4同）。

图1 姜黄素对小鼠海马CA1区神经元IRS1表达的影响（标尺50 μm）

Fig.1 The effect of curcumin on the expression of IRS1 of neurons in hippocampus CA1 area （Bar 50 μm）

图2 姜黄素对APP/PS1双转基因小鼠海马pIRS1蛋白表达的影响（标尺 50 μm）

Fig.2 The effect of curcumin on the expression of pIRS1 in the hippocampus of APP/PS1（Bar 50 μm）

表1 组间海马CA1区IRS1 和pIRS1阳性神经细胞数目比较（±s，n=6）

Table 1 Number value of IRS1 and pIRS1 positive cells in hippocampal CA1 area in each group （±s，n=6）

注：与对照组相比1）P<0.01，2）P<0.05；与模型组相比3）P<0.01， 4）P<0.05（图3，4，表2同）。

图3 姜黄素对APP/PS1双转基因小鼠海马IRS1表达的影响

Fig.3 The effect of curcumin on the expression of IRS1 of hippocampus of the APP/PS1 double transgenic mice

3.3 Realtime PCR检测APP/PS1双转基因小鼠海马IRS1 mRNA的表达 IRS1的cDNA扩增产物的熔解曲线为单一熔解峰，证明所得产物为特异性扩增产物，表明样本纯度较高。根据绘制的标准曲线得到IRS1基因及内参照βactin基因表达的相对浓度，以IRS1与βactin相对浓度的比值来反映IRS1的表达量。结果显示，与对照组相比，模型组小鼠正常IRS1 mRNA呈高水平表达（P<0.01），罗格列酮组、姜黄素各组IRS1 mRNA也有增高，与模型组相比均有不同程度的改善（表2）。

图4 姜黄素对APP/PS1双转基因小鼠海马pIRS1表达的影响

Fig.4 The effect of curcumin on the expression of pIRS1 of hippocampus of the APP/PS1 double transgenic mice

表2 IRS1 mRNA相对表达量（±s，n=6）

Table 2 Relative quantitative analysis of IRS1 mRNA（±s，n=6）

4 讨论

胰岛素和胰岛素信号转导通路在促进细胞存活发挥着重要作用。循环中的胰岛素可以调节脑功能（如血流量和能量代谢），中枢性胰岛素似乎对与学习记忆相关的脑区起到更重要的作用[3]。与学习、记忆相关的胰岛素受体分布于嗅球、下丘脑、大脑皮质、海马、扁桃体和小脑皮质，通过胰岛素信号转导蛋白磷酸化发挥作用。有研究显示脑葡萄糖利用率在认知功能下降之前已经受损，并提示低代谢是AD最早的可逆性标志之一[4]。葡萄糖代谢是AD 认知能力变化的敏感测量指标，并对预测未来认知缺陷加重有一定价值[5]。而“脑内胰岛素信号转导障碍”假说认为AD可能表现为一种脑特异性糖尿病，能量代谢异常主要是由于胰岛素抵抗和胰岛素功能低下，甚至研究者将其称为“3型糖尿病”[6]。因此改善胰岛素信号转导将成为治疗AD 的核心目标之一。

IRS1是调节胰岛素和IGF信号转导通路的最上游的信号转导蛋白，它有多个酪氨酸磷酸化残基和1个ATP/GTP结合位点，是通过胰岛素与胰岛素受体结合激活，发生自身磷酸化，生成它的活性形式pIRS1，进一步激活磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B （phosphatidylinositol3kinase/AKT，PI3K/AKT）通路，调节生长、代谢和下游存活PI3K，PI3K刺激葡萄糖转换。通过PI3K/AKT的正兴奋保证线粒体膜的完整性，抑制DNA损伤和线粒体功能障碍和前凋亡机制的抑制物的产生[7]，作用于靶基因使神经元存活。有活性的IRS1表达减少，表明维持神经元存活和代谢的有效激活下游通路的功能障碍，象征AD的胰岛素信号转导异常。IRS1分子在脑组织结构和功能维护起关键性作用，IRS1基因敲除小鼠表现体积很小，尤其是脑质量显著减低[8]。

作者以往的研究发现姜黄素可以改善APP/PS1双转基因小鼠学习记忆功能，改善AD小鼠海马突触结构，增加Aβ降解酶、减少Aβ生成酶[911]，存在胰岛素受体表达增高的胰岛素信号转导障碍，因此进一步对IRS1进行了研究，免疫组织化学和Western bolt结果显示IRS1蛋白在模型组表达也有明显增高，为了进一步研究IRS1是否存在mRNA的增高，应用RTPCR方法对IRS1 mRNA进行了测定，结果发现模型组IRS1 mRNA也明显增高，进一步进行了IRS1的活性形式pIRS1检测，结果发现模型组明显降低，说明增高的IRS1很可能是无功能的反应性增高。而罗格列酮组和姜黄素组治疗可以下调已经增高的IRS1 mRNA水平，进一步改善恢复增高的IRS1蛋白表达，使APP/PS1双转基因小鼠海马增加的IRS1和减少的pIRS1得以恢复，改善APP/PS1双转基因小鼠胰岛素信号转导。因此，姜黄素可以通过调节胰岛素信号转导机制发挥抗AD作用。

[参考文献]

[1] Urayama A， Banks W A. Starvation and triglycerides reverse the obesityinduced impairement of insulin transport at the blood brain barrier[J]. Endocrinology， 2008，149（7）：3592.

[2] Bharat B Aggarwal， Kuzhuvelil B Harikumar. Potential therapeutic effects of curcumin， the antiinflammatory agent， against neurodegenerative， cardiovascular， pulmonary， metabolic， autoimmune and neoplastic diseases[J]. Int J Biochem Cell Biol， 2009，41：40.

[3] Parrella E，Longo V D. Insulin/IGF1 and related signaling pathways regulate aging in nondividing cells：from yeas to the mammalian brain[J]. Scientifie World J， 2010，10：161.

[4] De la monte S M， Wands J R . Review of insulin and insulinlike growth factor expression， signaling， and nalfunction in the central nervous system： relevance to Alzheimer′s disease[J]. J Alzherimer′s Dis，2005，7：45.

[5] 王虹，高凱，王蓬文，等. MicroPET 观察姜黄素对APPswe/PS1dE9双转基因小鼠脑葡萄糖代谢的影响[J]. 实验动物学报， 2011，19（4）：66.

[6] Hoyer S， Nitsch R， Oesterreich K. Experimental methods commonly used in molecular glucose utilization in lateonset dementia of the Alzheimer type：a crosssectional comparison against adwanced lateinset and incipient earlyonset cases[J]. J Neural Transm Park Dis Dement Sect，1991，3：1.

[7] Jellinger K A. Basic meehanisms of neurodegeneration：a critical update[J]. J Cell Mol Med，2010，14（3）：457.

[8] Giulio Maria Pasinetti，Jaequeline A Eberstein. Metabolic syndrome and the role of dietary lifestyles in Alzheimer′disease[J]. J Neurochem， 2008，106（4）：1503.

[9] 魏鹏，李瑞晟，王虹，等. 姜黄素对APP/PS1双转基因小鼠突触相关蛋白表达的影响[J]. 中国中药杂志， 2012， 37（12）：1818.

[10] 王蓬文，王虹，李瑞晟，等. 姜黄素对APPswe/PS1dE9双转基因小鼠Aβ42及其降解酶NEP表达的影响[J]. 中国中药杂志， 2011， 36（8）：1079.

[11] 李瑞晟，王蓬文. 胰岛素及其信号转导通路与AD相关生物标记的关系[J]. 中国神经免疫学和神经病学杂志，2010，17（4）：294.

Effect of curcumin on hippocampal IRS1 and pIRS1 expressions in

APP/PS1 double transgenic mice

FENG Huili1，2， LI Ruisheng3， WANG Hong4， REN Ying1，2， SUN Haiyun1，2， YANG Jinduo1，2， WANG Pengwen1，2 *

（1.Grade III Laboratory of State Administration of Traditional Chinese Medicine， Key Laboratory of Pharmacology of

Dongzhimen Hospital Affiliated to Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100700， China；

2.Key Laboratory of Chinese Internal Medicine of Ministry of Education and Beijing， Dongzhimen Hospital，

Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100700， China；

3.The Second Hospital Affiliated to Xinjiang Medical University， Urumqi 830028， China；

4.Amcare Women and Children′s Specialized Health， Beijing 100016， China）

[Abstract] Objective： To observe the effect of curcumin on the expressions of insulin receptor substrate1 （IRS1） and phosphated insulin receptor substrate1 （pIRS1） in APP/PS1 double transgenic mice of the AD model. Method： Threemonthold APP/PS1 double transgenic mice were randomly divided into the model group， the positive rosiglitazone control group and curcumin high （400 mg·kg-1·d-1）， medium （200 mg·kg-1·d-1） and low （100 mg·kg-1·d-1） dose groups. The normal group was composed of nontransgenic mice under the same background. After they were orally administered for three months， they were detected with immunohistochemistry， Western blot and RTPCR. Result： According to IRS1 and pIRS1 immumohistochemical staining， the expression of IRS1 positive cells in hippocampus CA1 area in model mice was significantly higher than that of the normal control group （P<0.01）. Compared with the model group， the number of IRS1 positive cells in hippocampus CA1 area decreased （P<0.05 or P<0.01） and the number of pIRS1 positive cells in hippocampus CA1 area increased in all of curcumin intervention groups. Western blot results were consistent with IRS1 and pIRS1 protein expressions and immunohistochemistry results. RTPCR test showed opposite IRS1 mRNA expression results with immunohistochemistry and Western blot results. Conclusion： Curcumin can recover increased IRS1 and decreased pIRS1 in hippocampus of APP/PS1 double transgenic mice， increase IRS1 mRNA expression， and improve the insulinsignaling transduction in APP/PS1 double transgenic mice. This suggests that curcumin can regulate the insulinsignaling transduction mechanism and show an antiAD effect.

[Key words] curcumin； APP/PS1 double transgenic mice； IRS1； pIRS1

doi：10.4268/cjcmm20130905

[責任编辑 张宁宁]