血必净／甲基强的松龙对ＡＲＤＳ大鼠肺保护作用机制的研究

【摘 要】目的：探讨“菌毒并治”代表方药血必净注射液对急性呼吸窘迫综合征(ARDS)大鼠肺保护机制。方法：通过建立油酸诱导的大鼠ARDS模型，分别使用血必净、甲基强的松龙等药物干预，测定各组各时段血清中TGF-β₁、TNF-α水平，并观察肺组织病理学改变。结果：血必净组大鼠肺组织匀浆及血清中炎症因子水平改变与模型未干预组有极显著差异性(P<0.01)，在24h组时，其与甲基强的松龙组比较，明显改善，具有显著性差异(P<0.05)；光镜观察结果亦显示，血必净对肺组织的保护作用强于甲基强的松龙，以24小时组改变明显。结论：血必净注射液可通过抑制细胞因子的失控性释放，减轻大鼠肺组织病理改变，较甲强龙显示出更好的保护作用。

【关键词】血必净注射液 甲基强的松龙 急性呼吸窘迫综合征

The Study of Lung Protective Mechanical with Xuebijing/Methylpr- ednisolone on the Acute Respiratory Distress Syndrome in Rats

Zhang Qia，et al

【Abstract】Objective：The aim of the study was to investigate the lung protective mechanisms of the integrated traditional Chinese medicine Xuebijing injection pretreatment on oleic acid-induced acute respiratory syndrome(ARDS) in rats. Methods：The ARDS model in rats with oleic acid-induced was treated the Xuebijing injection， methylprednisolone(MP)，to measure the factors at different fixed time points，such as TGF-β₁、TNF-α in serum.At the same time， we observed the pathologic structure of lung under the optical microscope. Results：The expression of inflammation factors in serum with Xuebijing injection intervented，changed significantly as compared with those in ARDS-no-intervention grup(P<0.01).There were also significant difference between the Xuebijing injection grup and MP grups(P<0.05). At the same time，we observed the better protective effections of lung in Xuebijing injection grups than the MP grups under the optical microscope ，especially during the 24h grups. Conclusion：The Xuebijing injection and MP can protective the lung in the oleic acid- induced ARDS model in rats，but the Xuebijing injection is better. It`s protective mechanisms maybe through inhabit the overflowing of inflammation factors and improving the pathologic structure in lung.

【Key words】Xuebijing injection Methylprednisolone(MP) Acute respiratory distress syndrome(ARDS)

急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome， ARDS)是在严重感染、休克、创伤及烧伤等非心源性疾病过程中，肺毛细血管内皮细胞和肺泡上皮细胞损伤造成弥漫性肺间质及肺泡水肿，导致的急性低氧性呼吸功能不全或衰竭。临床上表现为进行性低氧血症和呼吸窘迫^[1]。已经成为严重创伤、大面积烧伤和严重感染等急性危重症的主要死亡原因之一。研究表明，中医中药在急性呼吸窘迫综合征治疗中，作用日益明显，血必净是危重病领域“菌毒并治”的代表方^[2]，本课题旨在通过动物试验探讨其对ARDS肺保护的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料。

1.1.1 实验动物：健康雄性Wistar大鼠72只，体重(250±50)g，60d龄，由第三军医大学大坪医院动物中心提供。

1.1.2 实验用药及器械：甲基强的松龙(MP)：法玛西亚善强公司(比利时)生产，批号001267。血必净：天津红日药业有限公司生产，国药准字Z2004033；油酸(上海化学品厂出品)；肿瘤坏死因子(TNF-α)试剂盒，转化生长因子-β₁(TGF-β₁)试剂盒均购自于大连泛邦生物有限责任公司。ML5000 生物显微镜(科视达(中国)有限公司)；7180-日立7180型全自动生化分析仪。

1.2 实验方法。

1.2.1 模型制作及分组：104只Wister大鼠按随机数字表分为四组，即正常对照组(A组)、ARDS未干预组(B组)、甲强龙治疗组 (C组)和血必净组(D组)；A、B、C、D组又根据观察时间点分为4h，8h，12h，24h组，每组均为8只。除A组外各组动物尾静脉注射油酸1.5ml/kg，同时腹腔内分别注射MP 2mg/kg(C组)、血必净注射液4ml/kg(D组)，其余各组同时腹腔注射等量生理盐水。模型制作方法参照Sux^[3]等报道。试验前，动物禁水6h，禁食12h；其中24h组，在试验观察至12h时，重复腹腔给药一次，剂量同前。

1.2.2 标本采集：各组大鼠分别于给定时间点予腹腔注射氯胺酮麻醉，麻醉生效后通过腹主动脉采集血样，然后放血处死取右上肺组织，用10%福尔马林液固定，待检。

1.2.3 指标检测：用ELISA法测定血清中TNF-α，TGF-β₁含量，具体操作流程及数据换算参见试剂盒说明书。

1.2.4 肺组织病理观察 开胸后立即予肺组织大体观察，摄像；同时取右肺上叶小块组织，用体积分数为10%的甲醛固定，苏木素-伊红(HE) 染色，光镜下观察肺组织水肿和白细胞浸润情况。由贵州省人民医院病理科负责切片、观察。

1.3 应用PEMS 3.1统计软件，计量资料以均数±标准差(x±s)表示，各组数据先行方差齐性检验，多组均数比较采用方差分析，均数间的两两比较采用t检验。P<0.05和P<0.01分别表示统计学差异有显著性或极显著性。

2 结 果

2.1 实验后血浆中TNF-α含量的变化结果统计表，见表Ⅰ。

2.2 实验后血浆中TGF-β₁含量的变化结果统计表，见表Ⅱ。

2.3 各组大鼠24h组肺组织病理观察结果。A组：肉眼见肺组织色泽淡红，表面光滑，无缺血坏死病灶；光镜下：×100及×200倍观察发现：肺泡结构清晰，肺泡壁薄，肺泡壁及间质内无炎性细胞浸润。B组：肉眼可见肺组织高度水肿，体积明显增大，重量明显增加；色泽不均，多呈暗紫红色，伴有多发灶缺血坏死病灶；切开面较多白泡样/血性物流出；光镜：广泛性、小灶性肺泡萎陷/不张，肺泡间质明显增宽、水肿、大量炎性细胞浸润，肺间质及肺泡腔内可见大量红细胞，可见微血栓形成。C组：肺组织轻度水肿，色泽红，肺组织表面有缺血坏死病灶，切面血性分泌物及泡样分泌物减少；光镜：少量炎症细胞浸润，肺间质增厚减轻，肺泡萎陷较明显减轻，肺泡结构较完整，萎陷肺泡明显减少。D组：肉眼见肺组织轻度水肿，体积较正常组稍增大，表面光滑，色红；光镜下：见少量炎症细胞浸润，肺泡结构完整，肺泡腔及间质内可见少量红细胞，未见明显肺泡萎陷；与C组比较，渗出及炎性浸润减轻，肺间质水肿减轻，肺泡内渗出较B组明显减少。

3 讨 论

由于急性呼吸窘迫综合症(ARDS)的病因多是肺外因素，近年来，随着危重病诊疗技术及心肺复苏水平的提高，发病率有增高趋势。尽管针对急性肺损伤支持治疗有了长足的进步，但ARDS的病死率未见明显减少。ARDS是机体炎症反应失控导致的自身破坏性反应的结果，ARDS是全身炎症反应综合征(SIRS)和多器官功能障碍综合征(MODS)在器官水平的表现。早期研究已表明，抑制巨噬细胞过度活化，减少细胞因子过度分泌，可以保护脏器功能，降低死亡率。

TNF-α是单核/巨噬细胞在内毒素、炎症介质、IL-1等细胞因子的作用下以自分泌方式生成的一种多肽，是参与炎症反应最重要的介质之一，对其他细胞因子参与炎症反应起诱导和调节作用^[4]，常通过下列途径导致肺损伤的发生及加重^[5]：①增加肺血管通透性；②导致细胞凝血和抗凝血机制平衡失调；③上调PMN、肺血管内皮细胞对补体片段CR₃以及ICAM-1、P选择素等黏附分子的表达；④延迟PMN凋亡；⑤激发中性粒细胞释放大量损伤介质等。故近年来认为阻断TNF-α的效应可成为治疗ALI/ARDS的靶心^[6]。

转化生长因子β₁(TGF-β₁) 由多种细胞以自分泌、旁分泌和内分泌的方式通过受体信号转导促进细胞多种蛋白质的合成，目前认为其为保护性炎症介质。可通过以下途径增加ECM合成并减少其降解：①刺激成纤维细胞内胶原mRNA水平的提高，在转录水平调控胶原合成。②抑制胶原酶、弹性蛋白酶等金属蛋白酶的产生，减少纤溶酶原转换为纤溶酶，诱导生成纤溶酶原激活抑制剂，促进蛋白酶抑制剂的分泌，减少ECM的降解；③调节ECM表面整合素受体的表达，加速细胞与基质的黏附以及ECM沉积^[7]。

本研究显示，各ARDS模型组TNF-α、TGF-β₁水平均较正常对照组明显升高；ARDS未干预组TNF-α表现持续上升趋势，但上升趋势逐渐减弱，考虑与抗炎因子如TGF-β₁等释放有关，致炎与抗炎二者之间平衡遭到破坏，以及炎症因子的二次释放所致；随着药物干预的生效，打破炎症因子间自身变化的规律，故在12h时，两药物干预组TNF-α均较4h时下降，与正常对照组、ARDS未干预组比较，有极显著性差异；24h时，两药物干预组TNF-α均明显低于ARDS未干预组，血必净组较甲强龙组明显下降。各ARDS模型组TGF-β₁在12h时，出现一明显降低趋势，在24h时又逐渐上升，考虑与其自身代谢有重大关系，加之所引起的炎症因子二次释放，故随着时间的推移，又表现出上升趋势。由于药物干预，12h时，ARDS未干预组与血必净组显示出极显著性差异性；24h时，除正常对照组外，均上升至最高水平，两药物干预组明显高于ARDS未干预组，血必净组亦明显高于甲强龙组，两组亦显示出显著性差异。

肺组织光镜结果亦显示各干预组24h改变最为明显，且血必净组肺泡及肺间质水肿、炎性细胞浸润、微血栓形成等均较甲强龙组及ARDS未干预组明显改善。大量研究显示甲强龙：①可保护毛细血管内皮细胞，防止白细胞和血小板聚集、黏附管壁形成微血栓；②可稳定溶酶体，降低补体活性，抑制细胞膜上磷脂代谢，减少花生四烯酸的合成，阻止前列腺素(PG)及血栓素A₂(TXA₂)的生成；③具有抗炎和促进肺间质液体吸收^[8]，促进肺泡Ⅱ型细胞分泌表面活性物质^[9]，缓解支气管痉挛，抑制肺纤维化等多种功能^[10]。但近年来大量研究表明糖皮质激素有较大争议，其使用并不能改善ARDS预后或降低脓毒血症患者ARDS的发生率，且不能减少病死率^[11]。血必净含多种活血化瘀中药，其基础与临床研究证明能改善器官的微循环，增加血流量，减少血小板的粘附和聚集，抑制纤维母细胞合成胶原，减少血栓形成，提高组织摄氧能力并能清除自由基和超氧阴离子。主要成分中的赤芍能减少急性炎症时毛细血管的通透性，减少炎性渗出，改善局部的血液循环，促进炎症的吸收，并使炎症病灶局限化，抑制炎性肉芽肿的形成^[12]。同时川芎嗪还可以抑制组织缺氧时钙离子内流，产生扩血管作用。临床实践证明，血必净具有强效抗内毒索作用，也有强效拮抗内毒素诱导单核/巨噬产生的内源性炎性介质，失控性释放的作用，增加血小板以及纤维蛋白原含量，增加血小板聚集力，改善弥漫性血管内凝血的凝血机制异常，提高超氧化物歧化酶活性等作用，同时能够调节过高或过低的免疫反应，保护和修复应激状态下受损的脏器^[13]，且其副作用较小。

本实验研究证明，甲基强的松龙和血必净均能下调致炎介质TNF-α，且均能升高具有保护性作用的TGF-β₁，病理结果亦显示有明显的改善；但血必净较甲强龙显示出更好的保护作用。

参考文献

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