痰瘀同治方对冠心病痰瘀互结证小型猪模型中医证候评分的影响

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[摘要]目的：建立冠心病痰瘀互结证小型猪模型“拟临床”中医证候评分方法，观察痰瘀同治方对冠心病痰瘀互结证小型猪模型中医证候评分的影响。方法：将36只中国小型猪随机分为正常对照组、模型组、舒降之组、痰瘀同治方高、中、低剂量组（生药2.0，1.0，0.5 g·kg^-1），每组6只；除对照组外，其他各组高脂饲料喂养2周后，采用介入技术球囊损伤冠状动脉左前降支内皮，术后继续高脂饲料喂养8周，制备小型猪痰瘀互结证冠心病模型；术后给药8周，根据症状分级评分方法，分析各组动物冠心病痰瘀互结证主症、兼症、舌象和脉象评分的变化。结果：与对照组比较，模型组在高脂6周和10周时，主症、兼症、舌象和脉象评分均明显升高（P<0.05或P<0.01）；与模型组比较，痰瘀同治方不同剂量均能够降低6周和10周时主症评分；此外低剂量还能降低10周时舌象和脉象评分；中剂量能降低6周时舌象评分和10周时兼症、舌象和脉象评分；而高剂量则降低6周和10周时各项评分（P<0.05或P<0.01）。结论：痰瘀同治方能够改善冠心病痰瘀互结证小型猪模型主症、兼症、舌象和脉象评分，提示“拟临床”小型猪病证客观化评分对于中药新药研发具有重要意义。

[关键词]痰瘀同治方；痰瘀互结证；冠心病；中国小型猪；证候评分

[收稿日期]2013-07-11

[基金项目]国家“重大新药创制”科技重大专项（2009ZX09502-017，2012ZX09301002-004）；北京市科技专项；中药药理北京市重点实验室2012年阶梯计划项目（z121107002812036）

[通信作者]*刘建勋，研究员，博士生导师，E-mail：liujx0324@sina.com

[作者简介]林成仁，研究员，主要从事中药药理学研究，E-mail：chengren1230@sina.com中医证候是指疾病过程中某一阶段或某一类型的病理概括，反映疾病的阶段性本质，是辨证论治的前提和基础。因此以证候为核心的中医动物模型的研究是评价中药新药药效，预测药物毒性和副作用的一个重要手段和工具。但是由于实验动物与人体的巨大差异性，使以四诊方式通过相应症、舌、脉、形、色、神等症状与体征表现出来的证候难以在实验动物中得到完全的体现。近年来许多学者在气血两虚证、气阴亏虚等动物模型的建立以及实验动物爪、舌、体态、运动分析的研究成果都为证候动物模型研究的思路和方法提供了有益的借鉴^[1]。痰瘀互结证作为冠心病的一个主要证型，一直都是中医病证结合动物模型研究的重点之一。本研究以冠心病痰瘀互结证的临床外在表现为基础，在动物模型“拟临床”研究思路指导下，建立痰瘀互结证冠心病小型猪模型，根据前期关于“痰瘀互结证动物模型中医证候评分”研究的结果^[2]，采用痰瘀同治方对证施治进行干预，通过观察冠心病痰瘀互结证小型猪证候评分的变化，验证其重复性及可靠性，为其他一些病证结合动物模型的研究提供借鉴和示范，促使临床与基础研究的结合。

1材料

1.1动物中国实验小型猪（Chinese experimental miniature swine，CEMS），36只，雌雄不拘，体重15～20 kg，由北京北七家美乐养殖场提供，动物合格证号SCXK（京）2013-005。

1.2药物与试剂痰瘀同治方（TYTZ），主要由丹参、川芎、人参等中药组成，由中国中医科学院西苑医院实验研究中心药学室提供。舒降之（辛伐他汀）片（杭州默沙东制药有限公司，批号100061）。 戊巴比妥钠（德国进口分装，北京化学试剂公司，批号020402）；76%复方泛影葡胺注射液（上海旭东海普药业有限公司，批号071101）；高脂饲料组成：每100 kg高脂饲料中含胆固醇2 kg，胆盐0.5 kg，猪油10 kg，由北京科澳协力饲料有限公司提供，许可证编号SCXK（京）2009-0012。

1.3仪器MP150多导生理信息分析系统（美国Biopac公司）；BV Pulsera型C型臂X光机（荷兰飞利浦公司）；快速交换PTCA球囊扩张导管（管径=1.3∶1，美国Boston公司）；导引导丝，6F Cordis血管造影导管和球囊（均由美国Abbott公司提供）；ICE-CL31R低温离心机（美国Thermo公司）；TEC-7621C型心电监护仪（日本光电）；MP-100生理记录仪（美国Goleta公司）。

2方法

2.1痰瘀互结证冠心病小型猪模型的建立将文献方法进行改进^[3]，小型猪以高脂饲料喂养2周，每天每只900 g，在高脂饲料喂养的基础之上，用介入法行冠状动脉血管内皮损伤。具体操作：耳静脉注射戊巴比妥钠（30 mg·kg^-1）麻醉后，分离右侧颈总动脉，结扎远心端，置入6F动脉鞘管，从动脉鞘的侧管注入肝素200 U·kg^-1。在C型臂X光机透视下，以6F 35 L右冠导引导管置于左冠状动脉开口行左冠状动脉造影，观察猪冠状动脉的分布情况，造影后置入交换导丝，将导丝置入冠状动脉前降支（left anterior descending branch，LAD）中部，将球囊沿导丝进入LAD中部。根据实验动物间LAD血管直径的差异进行球囊加压8～12大气压（Atmosphere，ATM），持续30 s，反复3次，每次间隔1 min，间隔期间球囊不加压，扩张后维持球囊压力4～6ATM，同时轻微拉动球囊，距离约0.5～1.0 cm。完成后撤除导丝、球囊，再次造影观察LAD扩张情况，撤除导引导管，结扎颈总动脉，伤口清创，局部给予150万U青霉素，无菌缝合，单笼喂养观察，术中连续心电监护。术后继续给予高脂饲料（每天每只900 g）喂养8周。正常对照组只冠脉造影，不行介入损伤术，仅给予普通饲料喂养，每天每只900 g。

2.2分组及给药36只小型猪随机分为6组（每组6只，雌雄不拘）：正常对照组、模型组、舒降之组（0.001 g·kg^-1）、痰瘀同治方高、中、低剂量组（生药2.0，1.0，0.5 g·kg^-1）。术后第2天每天上午将药物拌于饲料中喂养，连续给药8周。

2.3体重指数测量测定小型猪体重（W）和体长（从两耳根中点连线的中部起，用卷尺沿背脊量到尾根的第一自然轮纹为止，L）。体重指数（body mass index，BMI）由公式（BMI=W/L2）计算得出。测定时间点为：高脂2周（术前或给药前）、高脂6周（给药后4周）、高脂10周（给药后8周）。

2.4舌象图像采集根据国际照明委员会CIE推荐的标准照明和观测条件，选取照明的几何条件按照45/0（照明/观察）安排光路，采用45/0条件能有效地将镜面反射部分排除在外。光源照度测量采用台湾泰仕TES-1330A数位式照度计，舌体处照度范围控制在2 500～3 000 Lux（勒克斯）。实验采用尼康D90数码单镜反光相机（最大像素4 288×2 848），配合尼康AF-S 微距尼克尔 60 mm f/2.8G ED镜头，镜头与舌面距离35 cm。以光圈F16，快门1/30 s，ISO 400的条件采集舌象。小型猪麻醉后水平俯卧于特制的可移动平台上，由一名助手用手掰开小型猪的嘴令其暴露舌头，由另外一名助手用无齿镊夹住舌尖约1 cm处将猪舌轻轻展平，拍摄舌面。采集舌底时，将小型猪体位改为仰卧，其他与采集舌面时方法相同。采集时间点同2.3项。

2.5小型猪无创血流动力学参数测定经过改装的针式电极分别固定于小型猪的双侧颈部和肋下缘中点等8个部位，在不同时间点分别记录无创血流动力学指标，包括心输出量（cardiac output，CO）、每搏输出量（stroke volume，SV）、外周血管阻力（systemic vascular resistance，SVR）、左心做功（left cardiac work，LCW）等4项主要参数。以上血流动力学参数分别记录于无创血液动力学监测系统。采集时间点同2.3项。

2.630点体表心电图自制多点固定式体表心电图电极（30个标测点）是在本实验室发明的心外膜电图的基础上改进而来，置于小型猪体表，于心脏体表投影处描记体表心电图（BS-ECG），数据记录于MP-100生理记录仪。以ST段升高大于0.8 mv为判断标准，计算心肌缺血程度（∑-ST：ST段升高总mV数）及心肌缺血范围（N-ST：ST段升高总点数）。采集时间点同2.3项。

2.7冠心病痰瘀互结证小型猪中医证候评分标准参照《中药新药治疗冠心病心绞痛的临床研究指导原则》（2002年版）以及前期工作基础^[2]，制定冠心病痰瘀互结证小型猪中医证候诊断及评分标准。

①主症（胸闷胸痛，胸膈痞满，刺痛固定）：以30点体表心电图（BS-ECG）进行评分，计算心肌缺血程度（∑-ST：ST段升高或降低总数）及心肌缺血范围（N-ST：ST段升高或降低总点数）。0分：∑-ST<10 mV；N-ST<5。1～2分：10 mV<∑-ST<15 mV；5

②兼症（痰多体胖，纳呆脘胀）：根据体重指数（BMI）和进食情况评分。0分：BMI<45 kg·m-2，进食正常。1～2分：45 kg·m-255 kg·m-2，进食很差。

③舌象及舌下脉络评分：采集数码图片，模拟病理图像分析研究。0分：舌质淡红，苔薄白。1～2分：舌质暗或舌下脉络紫胀，苔腻或黄或白滑。3～4分：舌质紫暗或舌下脉络紫胀，苔腻或黄或白滑。5～6分：舌质紫暗、紫斑或舌下脉络紫胀，苔腻或黄或白滑。

④脉象评分：通过记录无创血流动力学指标，包括心率（heart rate，HR）、心输出量（cardiac output，CO）、每搏输出量（stroke volume，SV）、外周血管阻力（systemic vascular resistance，SVR）、左心做功（left cardiac work，LCW）等5项主要参数反映脉象的改变。0分：上述参数基本与对照组无统计学差异。1～2分：上述参数有1～2项出现与对照组有显著性差异。3～4分：上述参数有3～4项出现与对照组有显著性差异。5～6分：上述参数有5～6项出现与对照组有显著性差异。

2.8统计学分析实验结果以±s表示， 采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）方法，方差齐性应用 Student-Newman-Keuls检验，方差不齐采用Tamhane′s T2检验。P<0.05为有统计学意义。

3结果

3.1主证评分高脂2周（给药前）时，各组间主症评分无明显差异。高脂6周（给药4周）和10周（给药8周）时，与对照组比较，模型组动物主症评分明显升高（P<0.01）；与模型组比较，舒降之组与痰瘀同治方3个剂量组动物主症评分均明显下降（P<0.05或P<0.01），见表1。

3.2兼证评分高脂2周（给药前）时，各组间兼症评分无明显差异。高脂6周（给药4周）和10周（给药8周）时，与对照组比较，模型组动物兼症评分明显升高（P<0.05或P<0.01）；与模型组比较，舒降之组兼症评分明显下降（P<0.05）；痰瘀同治方低剂量组兼症评分无明显差异，而中剂量组高脂10周时兼症评分明显降低（P<0.05），高剂量组高脂6周和10周时的兼症评分明显降低（P<0.05或P<0.01），见表2。

3.3舌象评分高脂2周（给药前）时，各组间舌象评分无明显差异。高脂6周（给药4周）和10周（给药8周）时，与对照组比较，模型组动物舌象评分明显升高（P<0.01）；与模型组比较，舒降之组舌象评分明显下降（P<0.05或P<0.01）；痰瘀同治方中、高剂量组在高脂6周和10周时的舌象评分均明显下降（P<0.05或P<0.01），而痰瘀同治方低剂量组仅高脂10周时的舌象评分明显下降（P<0.05），见表3。

3.4脉象评分高脂2周（给药前）时，各组间脉象评分无明显差异。高脂6周（给药4周）和10周（给药8周）时，与对照组比较，模型组动物脉象评分明显升高（P<0.05或P<0.01）；与模型组比较，舒降之组脉象评分无明显差异；痰瘀同治方中、低剂量高脂10周时的脉象评分明显降低（P<0.05或P<0.01）；痰瘀同治方高剂量高脂6周和10周时的脉象评分均明显降低（P<0.05或P<0.01），见表4。

4讨论

痰瘀互结证是冠心病的常见证型，主要表现为胸闷胸痛，胸膈痞满闷痛，痰多体胖，纳呆脘胀等症状及舌象、脉象改变。四诊辨证施治是中医临床最突出的诊疗特色。但是在现有的实验研究中，由于人类与实验动物的种属差异，对于研究对象动物而言， 缺乏有效的沟通手段和模拟的研究方法， 使中医临床的四诊信息在实验动物上难以实现。但是在“拟临床”研究模式的基础上，可参考现代医学研究方法，将四诊主观化信息进行客观化转化，并进行定性、分级量化，这为实验动物的中医准确的辨证提供一个重要的途径。本研究以冠心病痰瘀互结证作为研究出发点，采用高脂饲料喂养与冠状动脉损伤内皮结合的方法建立冠心病痰瘀互结证小型猪模型，主要借鉴中医临床“痰”、“瘀”的辨证特点，通过主观症状和体征进行客观化转化，采用证候客观化评分的方法模拟动物在中医证候四诊方面的表现，以达到中医动物模型辨证的目的。首先采用30点体表心电图特征性心肌缺血变化模拟冠心病胸痛的症状；心电图理论认为导联ST变化与心肌缺血密切相关，ST抬高或下移幅度越大，ST变化导联数越多，心肌缺血程度和范围就越大；相比胸痛的严重程度，导联ST变化更能反映心肌缺血程度和范围。其次通过BMI及进食情况反映痰多体胖，腹满纳呆等痰浊内阻证的症状。研究显示BMI与血脂升高有明显的相关性^[4]，而目前认为血脂代谢紊乱是“痰”证的重要客观表现，血脂代谢异常引起血液流变学的改变，致血管内皮形态与舒缩功能损伤，同时激活血小板功能和内源性凝血系统，导致血液凝固性增高；脂质在血管壁沉积，促使血管内皮平滑肌过度增殖及细胞凋亡，形成粥样硬化斑块，阻碍血液运行，形成血液“浓、凝、黏、聚”的瘀血状态^[5]，这在一定程度上阐释了痰瘀互结证的客观病理基础。由此反映在舌象上，则出现舌质紫暗、紫斑或舌下脉络紫胀，苔腻或黄或白滑等表现。本研究仅对舌象变化进行主观评分分析，而对痰瘀互结证舌象色泽变化的客观分析将在随后进行研究。最后，采用无创血流动力学的方法来反映脉象的改变；心脏搏出的血流及血管壁的改变必然导致的压力扰动和流量扰动的变化。已有研究证实，脉象图波幅的高低与心脏收缩功能的强弱显著相关^[6]；在消化性疾病中患者血流动力学与病变过程和中医脉象有明显的相关性^[7]。本实验结果显示，模型组动物随着心肌缺血时间的延长，心电图ST段变化幅度及ST变化的测定点的总数也均升高，对应的证候主症评分升高；同时兼症、舌象、脉象的评分也随造模时间的延长而逐渐升高。表明采用动物模型客观化的评分方法能在一定程度反映了小型猪冠心病痰瘀互结证的发展变化，从而验证疾病证候的可靠性。

对证中药痰瘀同治方具有祛痰活血，化瘀通络的功效，能够降低小型猪冠心病痰瘀互结证主症、兼症、舌象和脉象的评分。而辛伐他汀则主要体现在对兼症的改善作用，尽管能够减少主症群的表现，但是对舌象以及脉象评分改善的不明显效果说明血瘀证客观病理变化的存在，而单纯的针对动脉粥样硬化病理过程的单一靶点治疗不能取得满意的综合疗效。综合上述，采用四诊客观化评分的方法能够在冠心病痰瘀互结证小型猪中进行证候客观辨证，具有较好的稳定性和可重复性，痰瘀同治方能够改善冠心病痰瘀互结证小型猪主症、兼症、舌象和脉象的评分，也进一步从辩证施治的角度验证了“拟临床”小型猪病证客观化评分对于中药新药研发的重要意义。但是该评分方法还需要在今后的深入研究中改进其存在的不足之处。

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