姜黄素对APP/PS1双转基因小鼠海马CA1区AKT及p—AKT表达的影响

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[摘要] 目的：观察姜黄素对AD模型APP/PS1双转基因小鼠丝/苏氨酸激酶（serine-threonine kinase， AKT，又称PKB）和磷酸化的丝/苏氨酸激酶（phosphorylated serine-threonine kinase， 即p-AKT）表达的影响。方法：将3月龄的APP/PS1双转基因小鼠随机分为5组，分别为模型组、罗格列酮组（10 mg·kg^-1·d^-1）、姜黄素高、中、低剂量组（400，200，100 mg·kg^-1·d^-1），选取同月龄同背景的非转基因小鼠为对照组。连续灌胃3个月后，应用免疫组织化学和Western blot方法检测小鼠海马CA1区中AKT和p-AKT的蛋白表达。结果： 免疫组化染色，模型组小鼠大脑海马CA1区AKT和p-AKT阳性细胞均较对照组明显减少（P<0.05，P<0.01），与模型组相比，罗格列酮组与姜黄素高、中剂量组AKT和p-AKT阳性细胞均有明显恢复（P<0.05，P<0.01），其中姜黄素中剂量组p-AKT阳性细胞数增加最为显著（P<0.01）。Western blot检测结果与免疫组化结果基本一致。结论：姜黄素可以使AD模型APP/PS1双转基因小鼠海马CA1区中减少的AKT和p-AKT细胞有所恢复，提示姜黄素可能通过调节AKT及其磷酸化过程，从而进一步调节PI3K/AKT途径的胰岛素信号转导通路发挥抗AD作用。

[关键词]姜黄素；APP/PS1双转基因小鼠；丝/苏氨酸激酶；磷酸化的丝/苏氨酸激酶

迄今为止，阿尔茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）的发病机制还不十分确切，研究表明，脑内胰岛素缺乏及胰岛素抵抗所致的脑胰岛素信号转导障碍是散发性AD（sporadic AD，SAD）神经变性病级联反应的核心环节^[1-2]。磷酯酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol-3-kinase， PI3K）/AKT途径是目前公认的主要胰岛素信号通路之一。AKT是PI3K下游的直接效应器，AKT激酶的活化可以使许多底物磷酸化，从而调控多种细胞生物功能^[3-4]。PI3K可通过激活AKT/蛋白激酶B （protein kinase B，PKB）和抑制糖原合酶激酶3（glycogen synthase kinase-3，GSK-3β）来刺激葡萄糖运输和抑制细胞凋亡，PI3K/AKT途径的胰岛素信号通路损伤可以降低AKT活性以及提高GSK-3β的活性^[2]，导致tau蛋白的超磷酸化，并在细胞内聚集为双螺旋丝，最终可造成神经元的死亡和丢失。此外，通过PI3K/AKT通路的正向刺激作用可保持线粒体膜的完整性，对导致线粒体DNA损伤、线粒体功能障碍和促凋亡的自由基生成起到抑制作用^[1]。因此，AKT，尤其是其磷酸化活化形式p-AKT蛋白的表达在AD发生发展的过程中起着至关重要的作用。

研究表明，中药单体姜黄素可通过抗炎、抗氧化、抑制β淀粉样蛋白（β-amyloid，Aβ）聚积、调节胰岛素转导通路等多种机制发挥抗神经退行性变的作用^[5-6]，本研究从胰岛素转导通路的PI3K/AKT途径，进一步研究中药单体姜黄素对AKT和p-AKT表达的影响，为寻找具有神经保护作用的姜黄素的潜在标靶提供依据。

1材料

1.1试剂 姜黄素（美国Sigma-Aldrich公司，批号c1386）；马来酸罗格列酮片[葛兰素史克（天津）有限公司，批号09060108]；羧甲基纤维素钠（CMC，北京精求化工有限责任公司，批号3405005），用前配成0.5%质量浓度，储存于4 ℃冰箱；一抗兔抗小鼠AKT抗体（Abcam公司，免疫组化效价1∶100，Western blot效价1∶500）；p-AKT抗体（Cell signaling公司，免疫组化效价1∶50，Western blot效价1∶500）；SABC免疫组化染色试剂盒、DAB显色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）；Western blot常规试剂SDS-PAGE凝胶配制试剂盒，RIPA组织/细胞裂解液，Tris base，十二烷基硫酸钠（SDS），过硫酸胺（ammonium persulfate，APS），脱脂奶粉，甘氨酸均为北京环亚泰克生物医学技术有限公司生产；ECL超敏底物化学发光检测试剂盒购自尚柏生物医学技术（北京）有限公司；PVDF膜（Millipore公司）。

1.2仪器 Mini-PROTEAN 3电泳仪购自BIO-RAD公司。

1.3动物 60只3月龄APP/PS1双转基因小鼠与12只同背景同月龄C57/BL6J正常小鼠，均购自中国医学科学院动物研究所，许可证号SCXK（京） 2009-0004，体重22～25 g，饲养于北京中医药大学东直门医院中药药理学实验室屏障环境动物室中[SYXK（京）2009-0028]。小鼠垫料为消毒垫料，购自中国医学科学院实验动物研究所。小鼠饲料为清洁级维持鼠料，购自北京科澳协力饲料有限公司 [SCXK（京） 2005-0007]，饮用水为消毒水。实验过程中动物自由摄食和饮水。

2方法

2.1分组及给药 将AD模型小鼠随机（随机数字由SPSS 17.0统计软件产生）分为5组：模型组、罗格列酮组、姜黄素高、中、低剂量组，每组12只。于3月龄时对小鼠分别实施灌胃治疗，每日1次，连续灌胃3个月。对照组为12只同月龄同背景C57/BL6J正常小鼠。模型组和对照组给予等体积0.5%CMC灌胃；罗格列酮组给予罗格列酮10 mg·kg^-1·d^-1灌胃；姜黄素各剂量组分别给予姜黄素400，200，100 mg·kg^-1·d^-1灌胃。

2.2取材及标本制备 新鲜组织标本：将小鼠快速脱颈椎处死，冰浴下剥离海马，将其置于EP管中，储存于-180 ℃液氮罐中以备Western blot蛋白印迹实验所用，每组各6只，左右海马。石蜡切片：末次行为学测试后，将小鼠灌杀，以多聚甲醛进行心脏灌注，之后取材、固定，将固定好的小鼠进行脑脱水、石蜡包埋、切片。每只小鼠脑于海马CA1区连续冠状切片，每张切片厚4 μm，每组各6只。

2.3免疫组织化学检测及分析 按说明书对相邻部位的脑片进行免疫组化染色。每只小鼠选取5张脑片，在20倍物镜下观察，记数海马CA1区内染色阳性神经细胞数目；并使用Image-pro Plus图象分析系统采集图像并进行分析，记录每组图像阳性细胞数及其平均灰度值。灰度值分为256（0～255）个，此指标反映的是一个点的颜色深浅程度，灰度值越小，颜色越深。

2.4Western blot检测 蛋白质提取、蛋白质电泳、转膜、杂交、显色，转膜时应蛋白面朝上，置于洁净保鲜膜上。将配制的发光检测液小心的用吸管转移到蛋白膜上，使其均匀覆盖，室温孵育1～2 min，避免出现气泡（或将气泡赶出），继而固定在X线片暗盒内（此过程需要在暗室内进行，但此时室内可有光亮）。在封闭的暗室中取一张X线片置于包裹的膜上，合上暗盒，曝光30 s至1 min。随即显影定影，根据其曝光强度，缩短或延长下一张X线片的曝光时间。使用Hp Scanjet G 4050将Western blot胶片扫描成TIF格式图片，用quantity one分析软件对各组条带进行分析，将各组的整合灰度比例与内参（β-actin）比较，并以β-actin的ID为100%，得到相对百分数（即 ID/内参ID×100%）。

2.5统计学分析 所得数据以

±s表示，采用统计软件SPSS 17.0进行统计分析，组间数据比较用单因素方差分析（One-way ANOVA）。以P<0.05为有显著差异，以P<0.01为有极显著差异。

3结果

3.1免疫组化法检测APP/PS1双转基因小鼠海马CA1区神经元AKT的表达 阳性反应细胞胞浆着色，胞浆内有棕黄色的阳性反应颗粒。海马CA1区阳性细胞体积较大， 呈圆形或椭圆形。模型组较对照组小鼠海马CA1区AKT阳性细胞明显减少（P<0.05）；与模型组小鼠相比，罗格列酮组、姜黄素高、中剂量组小鼠海马CA1区AKT阳性细胞显著增加（P<0.05），姜黄素低剂量组阳性细胞数亦有增加，但无统计学差异。Motic图像分析系统显示，模型组小鼠海马CA1区阳性细胞平均灰度值较对照组小鼠增加，染色变浅（P<0.01），罗格列酮组和姜黄素中剂量组小鼠海马CA1区AKT阳性细胞平均灰度值同模型组小鼠相比明显降低， 染色深（P<0.01），姜黄素高、低剂量组小鼠海马CA1区AKT阳性细胞平均灰度值也减低，染色加深（P<0.05）（表1）。

3.2Western blot蛋白印迹实验检测APP/PS1双转基因小鼠海马CA1区神经元AKT的表达 模型组小鼠海马CA1区AKT的蛋白表达条带均比对照组小鼠明显变窄、颜色变浅，表明其AKT蛋白表达减少（P<0.01）；与模型组小鼠相比，罗格列酮组小鼠海马CA1区AKT蛋白表达条带均明显变粗、颜色变深（P<0.01），姜黄素中剂量组蛋白表达条带也变粗、颜色变深（P<0.05）（图1）。

3.3免疫组化法检测APP/PS1双转基因小鼠海马CA1区神经元p-AKT的表达 海马CA1区阳性反应细胞胞浆和胞膜着色，胞浆内有棕黄色的阳性反应颗粒。阳性细胞体积较大，呈圆形或椭圆形。免疫组织化学染色的p-AKT阳性细胞计数，模型组较对照组小鼠海马CA1区p-AKT阳性细胞明显减少（P<0.01）；与模型组小鼠相比，除姜黄素低剂量组外，各干预组小鼠海马CA1区p-AKT阳性细胞均显著增加（P<0.01和P<0.05）。Motic图像分析系统显示，模型组小鼠海马CA1区阳性细胞平均灰度值较对照组小鼠显著增加、染色变浅（P<0.01），罗格列酮组和姜黄素中剂量组较模型组小鼠增加、染色变浅（P<0.01和P<0.05）（表2）。

3.4Western blot蛋白印迹实验检测APP/PS1双转基因小鼠海马CA1区神经元p-AKT的表达 模型组小鼠海马CA1区p-AKT的蛋白表达条带均比对照组小鼠明显变窄，颜色浅，表明其p-AKT蛋白表达减少（P<0.01）；与模型组小鼠相比，罗格列酮组和姜黄素中剂量组小鼠海马CA1区p-AKT蛋白表达条带均明显变粗，颜色变深（P<0.01），姜黄素高剂量组蛋白表达条带也变粗，颜色变深（P<0.05）（图2）。

4讨论

近年有学者认为AD是一种与胰岛素信号通路有关的神经内分泌疾病，流行病学研究表明，患有糖耐量异常、胰岛素分泌缺陷或2型糖尿病的人出现AD型痴呆症的风险显着增加，而尸检研究亦发现，AD患者脑中既存在胰岛素缺乏，也存在胰岛素受体抵抗，且当不存在2型糖尿病、肥胖或外周胰岛素抵抗的情况时，AD与进行性的脑胰岛素抵抗相关^[1]。此外，还有学者观察到罗格列酮等胰岛素增敏剂有助于保护突触功能，缓解认知功能的下降^[7]。

胰岛素信号通路具有调控神经元生长、存活、分化、代谢、基因表达和蛋白合成等功能。胰岛素与胰岛素受体（insulin receptor， InR）或胰岛素样生长因子1 （insulin-like growth factors， IGF-1）受体结合后，酪氨酸磷酸化胰岛素受体底物（insulin receptor substrate， IRS） [1]。IRS激活后的信号转导通路，目前较为公认的有PI3K/AKT途径、丝裂原激活的蛋白激酶（mitogen activated protein kinases， MAPK）途径等，其中PI3K/AKT途径是最为主要的信号转导通路^[2]。AKT，作为PI3K下游的主要效应分子，是丝/苏氨酸激酶家族中的一员，有3种亚型，AKT1，AKT2，AKT3，分别由PKBα，PKBβ和PKBγ编码，三者之间约有80%的同源性，都含有PH域，ATP结合位点和2个磷酸化位点。AKT是构成生长因子受体酪氨酸蛋白激酶下游各种级联信号的重要环节，在细胞生存、生长、再生、迁移、增殖、凋亡、代谢（脂类和葡萄糖）、细胞周期进程、骨骼肌和心肌的收缩以及胰岛素合成与分泌等功能过程中均起着重要的作用^[2]。

本课题组采用的实验动物为APP/PS1双转基因小鼠，该小鼠可在短期内大量产生Aβ42及ADDLs，出现随年龄增加而加重的拟AD病理改变，且2～3个月出现轴突肿胀，4～5个月出现老年斑，6个月可出现大量淀粉样斑块，是迄今为止公认的较为理想的AD动物模型^[8]。广泛的证据表明，中药单体姜黄素可以通过抗氧化、抗炎、抑制蛋白聚积、抗细胞凋亡、改善脑内胰岛素信号途径等对神经变性病起到神经保护作用。课题组既往研究发现，姜黄素可对损伤的胰岛素信号通路中降低的InR，IGF-1受体、IRS以及PI3K等起到恢复作用^[9-11]，针对胰岛素信号途径中下游的关键蛋白AKT及其活化形式p-AKT进行了进一步研究发现，模型组与对照组相比，AKT与p-AKT的阳性细胞数明显减少，平均灰度值明显增加，染色明显变浅，蛋白条带明显变窄，表明AKT与p-AKT在AD状态下存在明显的损伤。与模型组小鼠相比，各治疗组小鼠海马CA1区AKT与p-AKT出现不同程度的阳性细胞数增加，平均灰度值减低，染色变深，蛋白条带增粗、变深，以罗格列酮组与姜黄素中剂量组变化最为显著，姜黄素高剂量组的变化亦较为明显，姜黄素可以使APP/PS1双转基因小鼠已受损下调的AKT与p-AKT阳性细胞数与蛋白表达在一定程度上有所恢复，且中等剂量应用时效果为最佳，说明姜黄素可能通过调节胰岛素信号通路的PI3K/AKT途径而对AD进行神经保护。

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[11] 陈晓培，李瑞晟，王虹，等. 姜黄素对AD小鼠尿中相关神经丝蛋白的动态影响[J].中国中药杂志，2013，38（9）：1310.

Effect of curcumin on expression of AKT and p-AKT in hippocampus

CA1 area of APP/PS1 double transgenic mice

DANG Hui-zi1， 2， LI Rui-sheng3， WANG Hong4， REN Ying1， 2， SUN Hai-yun1， 2， YANG Jin-duo1， 2， WANG Peng-wen1， 2 *

（1. Laboratory of Pharmacology of Dongzhimen Hospital， Beijing University of Chinese Medicine，

Tertiary Laboratory of State Administration of Traditional Chinese Medicine， Beijing 100700， China；

2. Key Laboratory of Internal Medicine of Traditional Chinese Medicine under Ministry of Education and Key Laboratory of Beijing，

Dongzhimen Hospital， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100700， China；

3. The Second Hospital Affiliated to Xinjiang Medical University， Urumqi 830028， China；

4. Amcare Women and Children′s Hospital， Beijing 100016， China）

[Abstract] Objective： To observe the effect of curcumin on the expressions of AKT （serine-threonine kinase， AKT， also known as PKB） and p-AKT （phosphated serine-threonine kinase， p-AKT） in APP/PS1 double transgenic mice of the AD model. Method： Three-month-old APP/PS1 double transgenic mice were randomly divided into the model group， the rosiglitazone （10 mg·kg^-1·d^-1） group， and high （400 mg·kg^-1·d^-1）， medium （200 mg·kg^-1·d^-1） and low （100 mg·kg^-1·d^-1） dose curcumin groups. Non-transgenic mice of the same age and background were selected as the control group（n=12）. After all of the six groups were intragastrically administered for consecutively three months， the protein expressions of AKT and p-AKT in hippocampus CA1 area were detected by immunohistochemistry and Western blot. Result： The results of immunohistochemistry showed that the expression of AKT and p-AKT positive cells in hippocampus CA1 area significantly decreased in the model group （P<0.05 and P<0.01）. Compared with the model group， AKT and p-AKT positive cells of hippocampus CA1 area increased obviously in the rosiglitazone group and high and medium dose curcumin group （P<0.05 or P<0.01），especially the medium dose group （P<0.01）. The results of Western blot were consistent with that of immunohistochemistry. Conclusion： Curcumin can recover the decreased AKT and p-AKT cells in hippocampus CA1 area of APP/PS1 double transgenic mice of the AD model， suggesting that curcumin may regulate AKT and its phosphorylation process， as well as PI3K/AKT insulin signal transduction pathway， and show the anti-AD effect.

[Key words] curcumin； APP/PS1 double transgenic mice； AKT； p-AKT

doi：10.4268/cjcmm20131922