姜黄素对AD小鼠尿中相关神经丝蛋白的动态影响

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[摘要] 目的：通过动态观察阿尔茨海默病（Alzheimer′s disease， AD）模型（APP/PS1双转基因）小鼠尿阿尔茨海默相关神经丝蛋白（Alzheimerassociated neuronal thread protein， AD7CNTP）浓度的变化，判断姜黄素的治疗作用。方法：3月龄AD小鼠30 只，随机分为5 组，模型组、罗格列酮组（10 mg·kg-1·d-1），姜黄素治疗高、中、低剂量组（400，200，100 mg·kg-1·d-1）；另选用同月龄的C57BL/6J小鼠6只作为对照组。连续灌胃6个月，分别于灌胃4，5，6个月收集尿液，应用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测尿AD7CNTP 浓度的变化。结果：同一时间点小鼠尿AD7CNTP浓度变化组间比较：灌胃4，5，6个月后模型组与对照组相比小鼠尿AD7CNTP 浓度均较高（P<0.05）；其他各组小鼠尿AD7CNTP均较模型组浓度低，且仅有治疗4个月的姜黄素高剂量组与模型组相比无统计学差异。不同时间点小鼠尿AD7CNTP浓度的组内动态比较：随鼠龄增长各组小鼠尿AD7CNTP浓度均有所升高，但各治疗组均低于同时段的模型组。灌胃5个月和6个月与4个月相比，对照组与各治疗组组内比较均有显著差异（P<0.01），各组灌胃6个月与5个月相比存在差异但均无统计学意义。结论：随着AD小鼠病情的进展，尿AD7CNTP浓度存在波动，中药单体姜黄素可以抑制AD小鼠病程的进展。

[关键词] 姜黄素；阿尔茨海默病；阿尔茨海默相关神经丝蛋白；阿尔茨海默病小鼠

[稿件编号] 20130129005

[基金项目] 国家自然科学基金面上项目（81073076）；教育部高等学校创新团队项目（IRT0810）

[通信作者] *王蓬文，博士生导师，Tel：（010）84013195，Email：pw_wang@163.com

[作者简介] 陈晓培，硕士研究生，Email：pingqingsong15@163.com

阿尔茨海默病（Alzheimer′s disease，AD） 是一种隐匿起病、以进行性认知功能损害为临床特征的神经变性病[1]，部分学者认为AD属于神经内分泌疾病，甚至有学者认为AD是3型糖尿病。目前使用的AD诊断依据以临床表现为基础，参考病史、精神状态、认知及心理学检查结果进行判断，并排除其他可能导致痴呆的疾病。无创性尿液检测生物标记物辅助早期诊断和判断疗效简便易行，在一项盲法多中心前瞻性研究尿蛋白测量筛查疑似AD 患者的临床试验中，AD相关神经丝蛋白（Alzheimerassociated neuronal thread protein， AD7CNTP）在尿液中的含量检测被认为是确诊AD 的有效指标，符合率大于90%[2]。尽管AD已经发现了100多年，但仍然无有效应对措施，早期预防、早期发现、早期诊断、早期治疗尤为重要。现有的西药多限于对症治疗，不能改变AD的病理进程[3]。近年来国内外研究发现，中药单体姜黄素在神经变性病治疗中具有多靶点、多途径的独特优势，尤其在改善认知功能，减轻炎症反应等方面[4]。国内外研究亦发现中枢神经系统内神经元内富含胰岛素受体（insulin receptor， IR）和胰岛素生长因子1受体（insulinlike growth factor 1 receptor， IGF1R）易被AD7CNTP损伤[5]，而胰岛素增敏剂罗格列酮能够通过胰岛素信号转导途径改善认知[6]。采用AD（APP/PS1双转基因）小鼠是研究AD较为理想的实验动物[7]。本研究采用罗格列酮作为阳性对照药，以AD7CNTP 作为判断疗效指标，观察不同剂量、不同时间姜黄素对AD病程进展的影响，探索姜黄素的神经保护作用。

1 材料

1.1 药物及试剂 姜黄素为美国SigmaAldrich 公司产品（批号c1386）；羧甲基纤维素钠（carboxymethyl cellulose，CMC）由北京精求化工有限责任公司生产（批号3405005），用前配成0.5%浓度，储存于4 ℃冰箱；马来酸罗格列酮片为葛兰素史克（天津）有限公司产品（批号09060108）；AD7CNTP（ELISA法）检测试剂盒为深圳市安群生物工程有限公司生产（批号20091115）。

1.2 仪器 赛多利斯电子天平BS124S（德国）；DHP360型电热恒温培养箱（北京光明医疗仪器厂）；eppendorf微量加样器（德国）；CB128C 酶标仪（中国香港）。

1.3 动物 3月龄AD模型小鼠及同月龄同背景的C57BL/6J 正常小鼠，体重22～25 g，购自中国医学科学院实验动物研究所，许可证号SCXK（京）20090004。小鼠饲养和实验均在北京中医药大学东直门医院中药药理学实验室屏障环境动物实验室内进行[SYXK（京） 20090028]。小鼠饲料为清洁级维持鼠料，由北京科澳协力饲料有限公司供给[SCXK（京） 20050007]。小鼠垫料为消毒垫料，由中国医学科学院实验动物研究所提供。实验过程中动物自由摄食和饮水，水为消毒水。

2 方法

2.1 分组与给药 随机将3月龄AD模型小鼠30只分为5组，每组6 只。模型组、罗格列酮组（10 mg·kg-1·d-1）、姜黄素高、中、低剂量组（400，200，100 mg·kg-1·d-1），另选同月龄的C57BL/6J正常小鼠6只作为对照组；模型组和对照组给予等体积0.5%CMC。所有动物均实施每日1次灌胃，连续6个月。

2.2 尿液收集 采用代谢笼，分别于灌胃4，5，6个月收集尿液。尿液收集在1.5 mL EP管中，储存于4 ℃冰箱，于48 h 内检测。

2.3 AD7CNTP检测 采用AD7CNTP 检测试剂盒按说明书对小鼠尿液进行测定。①将所需的微孔条固定于板架上，编好顺序；在相应孔中分别加入100 μL的标准品或尿样（尿液均做副孔），用封口膜将条板封好（防止污染），37 ℃ 60 min；②取出板条，甩干尿样，在吸水纸上轻拍数下，每孔加入配制好的洗涤液200 μL，停留20 s，甩干，在吸水纸上轻拍数下，反复洗涤5次，在洗涤过程中避免产生气泡；③每孔加入多抗AD7CNTP抗体100 μL，空白孔不加；用封口膜将板封好，置37 ℃温浴30 min；④反应后，再次洗涤（同②），拍干；每孔加入酶联物100 μL，空白孔不加；用封口膜将板封好，置37 ℃温浴30 min；⑤反应后，再次洗涤（同②），拍干；每孔加入显色剂A和显色剂B 各50 μL，必须保证同一速度加入显色剂，中间不应有间断；⑥于37 ℃避光显色15 min后，尽快加入50 μL终止液于各孔中；⑦在酶标仪上选定450 nm波长，空白孔调零，测定每组的吸光度；⑧根据所测得吸光度计算相应的浓度值。

2.4 统计学处理 全部数据采用SPSS 17.0软件包进行统计学处理，计量数据以±s表示，各组均数间比较采用单因素方差分析（OneWay ANOVA），两两比较采用LSDt检验。P< 0.05为有显著性差异，P<0.01为有非常显著差异。

3 结果

3.1 同一时间点小鼠尿AD7CNTP浓度变化组间比较 灌胃4个月后模型组与对照组相比小鼠尿AD7CNTP 浓度较高（P<0.05）；其他各组小鼠尿AD7CNTP均较模型组浓度低，且仅有姜黄素高剂量组与模型组相比无统计学差异；灌胃5，6个月后，模型组较对照组小鼠尿AD7CNTP 浓度较高（P<0.05），其他各治疗组与模型组相比AD7CNTP 浓度均较低，除灌胃5个月后姜黄素低剂量组均有统计学意义（P<0.05），且灌胃5个月后罗格列酮组、姜黄素高、中剂量组及灌胃6个月后罗格列酮组与模型组相比AD7CNTP 浓度明显较低（P<0.01）（表1）。

表1 小鼠尿AD7CNTP浓度比较（±s，n=6）

Table 1 Comparison of AD7CNTP concentration（±s，n=6）

注：与对照组比较1）P<0.05；与模型组比较2）P<0.05，3）P<0.01；与治疗4个月比较4）P<0.05，5）P<0.01。

3.2 不同时间点小鼠尿AD7CNTP浓度的组内动态比较 随鼠龄增长各组小鼠尿AD7CNTP浓度均有所升高，但各治疗组均低于同时段的模型组。灌胃5个月与4个月，对照组与各治疗组组内比较均有显著差异（P<0.01），模型组组内比较无差异；灌胃6个月与4个月相比，对照组与各治疗组组内比较均有显著差异（P<0.01），模型组组内比较有差异（P<0.05）；各组灌胃6个月与5个月相比存在差异但均无统计学意义。

4 讨论

AD7CNTP是一个大约41 kDa跨膜磷蛋白，在异丙基βD硫代半乳糖苷的诱导下过度表达，累积在皮质神经元可导致大脑细胞骨架tau蛋白过度磷酸化，从而导致加速细胞凋亡和线粒体功能障碍。AD7CNTP存在IGF1R和IR结构域内，提示AD7CNTP的表达可能与胰岛素和胰岛素生长因子（insulinlike growth factors， IGFs）等刺激调节有关。体外实验表明，胰岛素、IGFs刺激会引起AD7CNTP表达和磷酸化增强[5]。尸检发现，脑组织中的AD7CNTP水平与对应的脑室液体相关，提示AD7CNTP是因死亡的细胞分泌并释放到脑脊液中[8]。相关研究发现，AD患者脑脊液和尿液中均可检测到AD7CNTP蛋白，且脑脊液和尿液中的AD7CNTP蛋白皆与痴呆的严重程度成正相关[910]。大量的研究表明AD7CNTP是一个很好的潜在的AD早期诊断的生物标志物[2，8]。

罗格列酮为噻唑烷二酮类氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）激动剂，用于增强细胞对胰岛素的敏感性，减轻胰岛素抵抗。体外实验表明，罗格列酮可抑制β位点淀粉样肽前体蛋白切割酶1（βsite amyloid precuror protein cleavage enzyme1，BACE1）的转录，从而减少Aβ [11]。

APP/PS1双转基因小鼠可在2～3个月出现轴突肿胀，4～5个月出现老年斑，6个月出现大量淀粉样斑块，是至今为止认为研究AD较为理想的动物模型[7]。中药单体姜黄素对AD从各个靶点产生广泛的影响作用，抗炎和抗氧化作用，阻止Aβ寡聚体的生成从而降低Aβ的毒性作用；还可以抑制淀粉样蛋白的新陈代谢和tau蛋白过度磷酸化[4，10]。因此，本实验采用以AD7CNTP为指标，罗格列酮为阳性药物，APP/PS1双转基因小鼠为AD模型动物，探索姜黄素的神经保护作用。

课题组前期研究发现，姜黄素灌胃治疗1个月后，各组小鼠尿AD7CNTP浓度均有不同程度的升高，可能因治疗还没有发挥明显的治疗作用所致。姜黄素高、中剂量和罗格列酮组在治疗2～3个月后与模型组相比差异均有统计学意义，推测药物在治疗2个月后開始发挥较显著的治疗作用[12]。

本实验在前期研究的基础上持续动态观察姜黄素灌胃4～6个月APP/PS1双转基因小鼠尿AD7CNTP 水平。连续姜黄素灌胃，虽然各组AD7CNTP的浓度均有一定程度升高，但同一时间点仍低于模型组，说明姜黄素仍可以持续保护神经元，减少AD7CNTP的产生。灌胃4～6个月，各治疗组除灌胃4个月姜黄素高剂量组与相同时间点模型组相比AD7CNTP的浓度降低且有统计学意义，结合课题组前期研究，可得出灌胃4个月姜黄素中剂量组的AD7CNTP的浓度最低，推测可能姜黄素中剂量为治疗AD小鼠7月龄之前的最佳剂量，随着病情的进展需加大姜黄素的剂量才可更好改善AD。不同时间点各组相比，对照组在灌胃6个月后，虽然AD7CNTP的浓度略有下降，但差异无统计学意义，推测可能AD7CNTP的浓度随着鼠龄的增长存在波动。模型组在灌胃6个月与5个月相比，AD7CNTP产生速度也明显降低，差异无统计学意义，提示可能因为病程进展，大脑萎缩神经元数目较前减少所致。罗格列酮组与姜黄素中、低剂量组均在灌胃6个月后AD7CNTP浓度也有相应下降，但姜黄素高剂量组在治疗6个月后仍较治疗5个月AD7CNTP浓度高，推测姜黄素高剂量通过保护神经元，阻止AD病情的进展。值得注意的是，虽然尿液中AD7CNTP的浓度在AD疾病发展过程中存在波动，模型组小鼠尿AD7CNTP浓度与同一时间点各治疗组相比浓度仍较高。

尿液AD7CNTP 可以作为AD早期辅助诊断的生物标志物，亦可以检测AD病程的进展及药物治疗的效果。随着AD病情的进展小鼠尿AD7CNTP浓度存在波动，大剂量姜黄素可以更好发挥作用。中药单体姜黄素可以在AD早期减少尿AD7CNTP产生，进而减少神经元损伤，晚期抑制神经元的萎缩，减缓AD病程的进展。但随着AD病程的进展，大脑皮质弥散性萎缩，神经元的数目是否会减少，AD7CNTP产生是否会提高或减低，姜黄素是否可以持续降低尿液AD7CNTP有待下一步实验观察研究。

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Dynamic effect of curcumin on urine concentration of

neuronal thread protein in AD mice

CHEN Xiaopei1，2， LI Ruisheng3， WANG Hong4， REN Ying1，2， SUN Haiyun1，2，

YANG Jinduo1，2， WANG Pengwen1，2 *

（1.Key Laboratory of Pharmacology of Dongzhimen Hospital， Beijing University of Chinese Medicine，

State Administration of Traditional Chinese Medicine， Beijing 100700， China；

2. Key Laboratory of Chinese Internal Medicine of Ministry of Education and Beijing， Dongzhimen Hospital，

Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100700， China；

3. The Second Hospital Affiliated to Xinjiang Medical University， Urumqi 830028， China；

4. Amcare Women and Children′s Hospital， Beijing 100016， China）

[Abstract] Objective： Through the dynamic detection of the concentration change of the urine Alzheimerassociated neuronal thread protein （AD7CNTP） in the curcumin treated Alzheimer′s disease （AD） model （APP/PS1 double transgenic） mice， the therapeutic effect of curcumin in AD was determined. Method： Thirty threemonthold APP /PS1 double transgenic mice were randomly divided into 5 groups， 6 in each group， the model group， rosiglitazone group（10 mg·kg-1·d-1）， high（400 mg·kg-1·d-1）， medium（200 mg·kg-1·d-1） and low（100 mg·kg-1·d-1） dose curcumin groups. Six C57BL/6J mice in the same age and genetic background were used as normal control group. All the 6 groups of mice were intragastrically administered for 6 months. Urine samples were collected on 4 month， 5 month and 6 month after intragastric administration， respectively. The changes of urinary AD7CNTP concentration were detected by enzymelinked immunosorbent assay （ELISA）. Result： The concentration of AD7CNTP of each group was compared at the same time point， the concentration of model group is higher than normal control group （P<0.05）； the concentration of other groups is lower than model group. The concentration of high curcumin dose group with 4 months treatment， has no statistical difference compared with model group. The AD7CNTP concentration of each group was elevated with the age growth， and all concentrations of the treatment groups were lower than the model group at the same period. With the treatment of 4， 5 and 6 months， the concentration of the normal control group has significant difference with the treatment groups（P<0.01）. There have no statistical difference between all the groups with the treatment of 6 months compared with 5 months. Conclusion： With the progression of the disease in AD mice， there are fluctuations in urinary AD7CNTP concentration， the compound curcumin from traditional Chinese medicine can delay the progression of AD.

[Key words] curcumin； Alzheimer′s disease； Alzheimerassociated neuronal thread protein； Alzheimer′s disease mice

doi：10.4268/cjcmm20130909

[责任编辑 张宁宁]