基于液质联用数据库技术的中药及天然产物化学成分快速鉴定方法的建立

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[摘要] 目的：应用液质联用数据库技术建立中药及天然产物化学成分的快速鉴定方法。方法：采用超高效液相色谱电喷雾离子化四级杆飞行时间串联质谱（UPLC-ESI-Q-TOF）技术，采集不同类型中药及天然产物化学成分的保留时间和质谱信息并建立质谱信息库，应用Masslynx工作站的Chromalynx XS模块的Identify功能，自动快速鉴定色谱图中各个色谱峰；运用保留时间校正方法，对相同化合物在不同色谱系统下的保留时间进行校正，以扩大该方法适应性。结果：该方法中建立的质谱信息库现收录了包含生物碱类、黄酮类、醌类、苯丙素类、萜类等不同类型的210余个化学成分的液质联用信息，包括正负离子模式下各成分的保留时间，准分子离子峰及其碎片离子的精确质量数。使用该方法进行样品成分鉴定测试，检出准确率90%左右。结论：与人工成分鉴定相比较，该方法简便、快捷、准确率高。保留时间校正方法的应用，一定程度上解决了不同色谱系统下保留时间不同导致质谱库无法统一的问题，扩大了本方法的应用范围。

[关键词] 中药及天然产物化学成分；化学成分快速鉴定；液质联用数据库技术；质谱信息库

中药化学成分研究是中药现代化研究的一项基础。目前，虽然大多数常用的中药已有系统化学成分研究报道，但这些成分的鉴定数据特别是常用的质谱信息的描述并不统一且缺乏系统整理，从而导致研究人员在进行化学成分鉴定时须花费比较多的时间整理文献中的化合物鉴定数据，再根据图谱进行人工搜索和匹配。先进的自动化成分鉴定方法对于提高中药及天然产物化学成分研究的效率和准确度具有很强的促进作用。本实验室长期致力于化学成分快速鉴定方法开发工作，已有一些成果^[1]。

当前，液质联用技术在中医药领域中应用颇多，无论是在中药化学成分体外^[2-3]体内^[4-5]鉴定，还是在当今流行的组学技术^[6]上，都显示出了其强大的能力。正因为其定性鉴别能力强，能够给出化合物专属信息，构建基于化合物液质联用的成分快速鉴定方法有很强的实用价值。成分快速鉴定的基础是液质联用质谱信息库，但目前还没有通用的、成熟的、商品化的液质联用的质谱库可用于图谱检索。实验室前期针对UPLC-Q-TOF液质联用仪开发了供成分鉴定用的液质联用质谱库，但在实践应用过程中发现该方法要求检索条件比较苛刻，难以将中药中复杂化学成分包围下的目标化合物与质谱库中信息进行准确匹配，因而准确率和效率不高。本文构建了一种更加快捷实用的液质联用成分鉴定方法，通过比较保留时间、准分子离子峰及碎片的准确质荷比来进行鉴定。检索方法中不再设定质谱图的匹配系数，很大程度避免了假阴性结果的出现，样品实例检索显示该方法简便快捷准确。同时，使用了保留时间校正方法，拓宽了本方法的应用条件。

1 材料

WATERS ACQUITY UPLC 超高效液相色谱系统（包含二元高压泵，自动进样器，柱温箱，二极管阵列检测器）；SYNAPT MASS质谱系统和Masslynx 4.1质谱工作站（美国Waters公司，SCN 803），EPED超纯水器（南京易普易达科技发展有限公司），BT 125电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）。

乙腈（色谱纯，美国Tedia公司），甲酸（色谱纯，德国Merck公司），超纯水（自制），其他试剂均为分析纯。标准对照品桃叶珊瑚苷、橙皮苷、槲皮素等购自中国药品生物制品鉴定所，延胡索乙素、芍药苷、甘草利酮、甘草苷等为实验室自制，纯度按HPLC面积归一化法>98%。本方法中建立的质谱信息库现收录了包含生物碱类、黄酮类、醌类、苯丙素类、萜类等不同类型的210余个化学成分的液质联用信息，化合物分类情况见表1。

甘草产自宁夏灵武市美康甘草基地，芫花产自安徽省六安市吴家店镇，大枣产自宁夏中宁，经南京中医药大学段金廒教授鉴定，甘草为豆科植物Glycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根及根茎，芫花为瑞香科植物Daphne genkwa Sieb. et Zucc.的干燥花蕾，大枣为鼠李科植物枣Ziziphus jujuba Mill.的干燥成熟果实，标本收藏于南京中医药大学江苏省方剂高技术研究重点实验室样品室。

2 方法

2.1 色谱-质谱条件 色谱条件：选择3根色谱柱Column A，Themo Syncronis C₁₈超高效液相色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm，SN 0318436A6）进样181次；Column B，Themo Syncronis C₁₈超高效液相色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm，SN 0318451A6）进样2 136次；Column C，Waters ACQUITY BEH C₁₈超高效液相色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm，SN 02003201015583）进样231次。柱温35 ℃；流速0.4 mL·min^-1；进样量2 μL；流动相A乙腈-B水（含0.1%甲酸）；梯度洗脱，0～4 min，5%～17% A，4～10 min，17% A，10～13 min，17%～30% A，13～16 min，30%～40% A，16～17.5 min，40%～50% A，17.5～22.5 min，50%～70% A，22.5～29 min，70%～100% A，29～31 min，100% A，31～32 min，100%～5% A，32～33 min，5% A。

质谱条件：电喷雾离子化（ESI），毛细管电压3 kV，锥孔电压30 V，碰撞能量6 V，MS^E碰撞能量15～45 V，离子源温度120 ℃，除溶剂温度350 ℃；除溶剂气体600 L·h^-1氮气；正负离子检测，扫描范围m/z 100～1 000，扫描时间0.2 s，碰撞气体为氩气，质量锁定溶液采用芦丁溶液。

2.2 样品溶液的制备 精密称取各对照品适量用甲醇配置成质量浓度为1 g·L^-1的标准溶液，各取等量标准溶液配置成各成分浓度相同的混标溶液，最终各化合物质量浓度为0.02 g·L^-1左右。精密量取芦丁、槲皮素、葛根素、芫花酯甲、新甘草酚溶液各200 μL，配置成各质量浓度为0.2 g·L^-1的校正标准品溶液。

甘草、芫花和大枣果肉用打粉机粉碎成粗粉，甘草和大枣各称取1 g，分别加20 mL甲醇超声30 min制成甘草提取液和大枣提取液；甘草和芫花各称1 g，混合后加甲醇20 mL超声30 min，制成芫花甘草混合提取液。上述提取液静置，经13 000 r·min^-1离心10 min，取上清液，0.22 μm微孔滤膜过滤即为样品，4 ℃保存，待测。

2.3 测试过程 质谱库建立：以Column A为标准色谱柱，采集各对照品图谱，提取各对照品保留时间和质谱信息，按照规定格式建立标准质谱库。分别在正负离子模式下采集对照品图谱建立质谱库。

样品成分鉴定：首先进样校正用标准品溶液，获得校正样品在该色谱柱上的保留时间，根据校正样品保留时间对标准质谱库中的保留时间校正，得到适用于当前色谱柱的质谱库。然后进样采集样品图谱，利用ChromaLynx XS软件进行质谱库检索和成分鉴定，输出成分鉴定报告。根据样品成分性质选择正或负离子模式采集数据进行鉴定。

3 结果与讨论

3.1 色谱质谱条件的确定 本实验定位于中药不同类化学成分的质谱库的建立，因此在色谱条件上选用文献中最为常见的流动相系统：0.1%甲酸溶液和乙腈。质谱条件上调节了毛细管电压、锥孔电压、离子源温度、除溶剂温度、除溶剂气体流速等参数，观察比较各条件改变对不同成分响应值、碎片分布的影响，最终确定一个响应值较高，准分子离子峰与碎片峰比例适中的质谱条件。采集所得混合标准品的总离子流色谱图，见图1。

3.2 质谱库的建立 本实验选用了Column A建立质谱库。从采集到的混合标准品一级质谱扫描总离子流图以及各化合物二级质谱图中分别提取各化合物保留时间以及二级碎片信息，建立适用于Chromalynx XS模块检索的文本文档标准品库，分为正离子和负离子2部分。部分负离子模式的化合物库，见图2。

在此基础上建立了包含有化合物的中文名、英文名、药材来源、CAS号、分子式、相对分子质量、保留时间和质谱信息的详细质谱库。以芍药苷为例，英文名paeoniflorin；药材来源白芍；CAS号23180- 57- 6；分子式C₂3H₂₈O₁₁；相对分子质量480；保留时间4.86 min；质谱碎片信息479，449，357（负离子模式）。该详细质谱库目前收录210余个化学成分信息，并且可以逐个添加新的化合物信息。

3.3 保留时间校正 液质联用分析中流动相的组成、梯度、色谱柱种类等条件变化都会对保留时间、质谱响应等重要鉴定参数造成影响，因此液质联用的质谱库通常都要求在指定仪器、指定色谱柱和流动相梯度等条件下应用。当液相系统的条件发生变化时，原有的质谱库就无法应用。这显然与成分鉴定的要求不适应，也是缺少商业化的质谱库的主要原因。为了尽可能的扩大质谱库的应用范围，根据实际工作中可能会使用不同色谱柱、但流动相系统相对恒定的特点，本文引进了保留时间校正方法，根据不同色谱柱上相同标准品的保留时间通过校正生成适用于当前色谱柱的质谱库，使本鉴定方法能在不同色谱条件上得到应用，提高了本方法的实用性。

相同流动相条件下色谱保留时间主要与系统和色谱柱有关，系统主要包括管路设计，色谱柱包括填料和封装技术。根据王龙星^[7]提出的理论在相同的操作条件下不同C₁₈柱的焓变ΔH与熵变ΔS是相同的，其主要不同之处在于其填料相比β，且同一根柱子新旧程度不同相比β也不同，同时由装柱过程带来的填料间孔隙的大小与几何性状的不同以及色谱柱本身长度的不同也可引起的不同C₁₈柱间死时间的差别。通过数学证明，同一液相色谱系统上，组分在2根相同填料色谱柱上的保留时间为简单线性关系。

选用混标中极性不同的5个化合物作为校正标准品，分别为葛根素（puerarin）、芦丁（rutin）、槲皮素（quercetin）、新甘草酚（neoglycyrol）和芫花酯甲（yuanhuacin），其保留时间均匀分布在整个运行时间内且质谱正负离子模式下均响应良好，其色谱图见图3。选择Column A采集所得保留时间作为基础，与其他色谱柱采集所得保留时间建立线性校正，从而将质谱库移植到其他色谱柱条件下。保留时间及校正曲线见表2，3。

校正前后谱图中各峰保留时间的绝对误差，见表4。从表4可看出对同一品牌使用时间不同的色谱柱所有化合物校正后保留时间绝对误差均值在0.1 min以内，校正结果良好，能够满足成分鉴定需要；而对不同品牌色谱柱校正后保留时间绝对误差均值0.57 min，结果不理想。Syncronis色谱柱采用100 高纯硅胶作为基质，Waters BEH 系列色谱柱所用的是亚乙基桥化颗粒^[8]，且两者灌装技术存在较大的差异，这可能是导致保留时间线性校正不准的原因。以上结果显示，线性校正可以较好地校正相同品牌相同型号色谱柱的保留时间，但对于不同品牌不同型号色谱柱校正效果不佳。因此，针对同一品牌型号的色谱柱，只需根据一根色谱柱建立质谱库，对其他同型号色谱柱建立校正曲线，通过保留时间校正更新谱库，即可进行成分鉴定；对不同品牌色谱柱，则应建立不同的质谱库。据此，对质谱库生成的一个软件进行开发，见图4。参考质谱校正原理，在保留时间校正上尝试性选用了二阶校正模型，结果见表5，说明二阶校正与线性校正差别不大，推荐使用更为简单的线性校正方法。

3.4 碎片离子的作用 通常情况下化合物可以通过液质联用仪采集得到的准分子离子峰以及保留时间信息与库中标准品信息对照进行鉴定。但若碰到和目标化合物互为同分异构体或结构相似的化合物，两者在色谱行为和一级质谱信息上极有可能表现接近，此时的鉴定结果就不一定准确。碎片离子的引入可以提高化合物鉴定的准确性和可靠性。本文采用的Synapt Q-TOF-MS仪器带有MS^E功能，能在一次进样中同时得到化合物的准分子离子和不同碰撞能量下的碎片离子数据，可直接被软件用于化合物鉴定。…

3.5 化学成分快速鉴定 本文建立的成分鉴定方法包括数据采集、保留时间校正、质谱库生成、成分检索鉴定及报告输出等6步，其中成分的检索鉴定是基于Masslynx工作站的Chromalynx XS模块的鉴定功能，以实现自动快速的化合物鉴定。其基本过程包括色谱峰的提取、积分、生成质谱图、与质谱库比对等步骤。本课题的前期研究中已经阐述了Chromalynx的工作原理，并运用此软件对所建谱库进行检索，但在实际应用过程中发现由于实验条件变化、杂质干扰以及中药方剂分析的复杂性等原因使得匹配条件比较苛刻，鉴定的准确率不高。本文在此基础上运用了Chromalynx XS升级版的功能，通过保留时间和准分子离子峰、碎片离子进行确认分析，化合物匹配程度较高。匹配后得到的化合物可以进入实验室自建详细库查询详细信息。

Chromalynx XS鉴别方法设置，库文件路径设置，保留时间误差± 0.1 min（参照校正后保留时间差值设置），起止时间0～33 min，扫描范围m/z 100～1 000，最大质量偏差15 mDa，精确质量范围3 mDa，此外还需根据样品情况设置峰积分参数，平滑参数，峰阈值等等，见图5。之后运行样品鉴定检索，鉴别结果见图6。图6中Target compound List窗口中显示“√”、“？”情况可认定该物质被检出；“×”情况则视为没有检出。以上条件是在有标准品确定保留时间的情况下设置的，在没有对照品确定保留时间，只有离子碎片信息的情况下，检索也可以执行，但失去保留时间的佐证，检索结果可信程度下降。

本实验运用了保留时间校正方法，对于不同色谱柱条件下的样品数据也可以得到理想结果。在设置了相关参数后考察了甘草醇提液、大枣醇提液、甘草和芫花混合提取液中的成分鉴定情况，正负离子模式下的鉴定结果合并，鉴定结果见表6，与参考文献[9-12]中化合物信息相比，结果准确率90%左右。除样品采集时间外，全部鉴定过程可在0.5 h内完成较人工鉴定方式方便快捷。

4 小结

中药物质基础研究是中药现代化研究的基础。中药成分复杂繁多，传统的成分鉴定方式是一项费时费力的工作，在很多情况下也是一项重复劳动。本方法建立的中药成分快速鉴定方法以液质联用分析为基础，集成了已知化合物标准品信息，可以快速、准确鉴定样品中所含化学成分，具有很强的实用价值。随着以后质谱库信息的逐步增加完善，将在中药质量标准、谱效学、药物代谢等研究中起到越来越重要的作用。同时，不同色谱柱、不同流动相、不同仪器下的质谱库和鉴定方法也在进一步开发中，不断扩大本方法的使用范围。

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Construction of a rapid identification method for chemical constituents in

traditional Chinese medicine based on liquid chromatography-

hybrid mass spectrometry-database

QIAN Ye-fei， SHANG Er-xin*， DUAN Jin-ao*， QIAN Da-wei， TANG Yu-ping

（Jiangsu Key Laboratory for High Technology Research of Traditional Chinese Medicine Formulae，

Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing 210046， China）

[Abstract] To establish a rapid component identification method for chemical constituents contained in traditional Chinese medicines and natural products by using liquid chromatography-mass spectrometry database technology. Method： Ultra-high performance liquid chromatography electrospray ionization quadrupole time-of-flight mass spectrometry （UPLC-Q-TOF-MS） was applied to collect the retention time and mass spectrum data of chemical constituents contained in traditional Chinese medicines and natural products， and establish a mass spectrum database. The Identify function from Chromalynx XS module in Masslynx workstation was applied to identifiy each chromatographic peak in an automatic and rapid manner. The retention time correction method was used to correct the retention time of identical compounds in different chromatographic systems， in order to improve the adaptability of the method. Result： Currently， the UPLC-MS library contains LC-MS information of more than 210 such chemical constituents as alkaloids， flavonoids， quinones， phenylpropanoids and terpenes， including retention times， xact molecular weights of quasi-molecular ion peaks and their fragment ions under positive and negative modes， respectively. The detection rate of identifying samples by suing the method was around 90%. Conclusion： Compared with manual identification， the method is simple， rapid and highly accurate. The usage of the linear correction for retention times helps solve the disunity of mass spectrum databases caused by different retention times in different chromatographic systems to a certain extent， and expand the application range of the method.

[Key words] chemical constituent contained in traditional Chinese medicine and natural product； rapid identification of chemical constituent； liquid chromatography-mass spectrometry database technology； mass spectrum information library

doi：10.4268/cjcmm20122121

[责任编辑 孔晶晶]

[稿件编号] 20120730012

[基金项目] 国家重点基础研究发展计划（973计划）项目（2011CB505300，2011CB505303）； 国家自然科学基金项目（30902015）；江苏高校优势学科建设工程资助项目

[通信作者] *尚尔鑫，博士，研究方向为中药方剂成分分析及数据挖掘研究，Tel：（025）85811916，E-mail：eshex@163.com； *段金廒，教授，博士研究生导师，研究方向为中药资源化学及中医方剂物质基础与生物效应研究，Tel：（025）85811916，E-mail：dja@njutcm.edu.cn