淫羊藿苷对微重力下骨髓间充质干细胞增殖与凋亡的影响

[摘要] 目的 探討淫羊藿苷（ICA）对微重力下骨髓间充质干细胞（BMSCs）增殖与凋亡的影响。 方法 将BMSCs随机分为3组：微重力组、加药组和对照组，其中微重力组固定于平行平板旋转微重力效应模拟器于培养箱中培养，加药组将微重力和1×10-6 mol/L ICA同时应用于细胞，对照组正常培养，不进行任何附加操作。采用MTT法检测BMSCs增殖，每组设置3个复孔；流式细胞术（FCM）检测BMSCs凋亡，每组细胞分3次测量；实时定量PCR（qPCR）检测BMSCs凋亡相关基因，每个样本的每种基因设置3个复孔；透射电镜（TEM）观察BMSCs亚细胞结构的变化。 结果 MTT法检测显示，微重力组吸光度值显著低于对照组（P < 0.01），加药组细胞吸光度值明显高于对照组（P < 0.01）。流式细胞术检测显示，微重力组细胞凋亡率明显高于对照组（P < 0.01）；加药组细胞凋亡率明显低于对照组（P < 0.01）。qPCR检测提示，微重力组Bcl-2、Bax/Bcl-2、P53和Bax的表达水平均较对照组明显升高（均P < 0.05）；加药组P53、Bcl-2、Bax和Bax/Bcl-2的表达均较微重力组显著降低（均P < 0.01）。透射电镜下可见，加药组细胞形态大致正常，与对照组比较，未发生明显变化，微重力组部分细胞可见细胞膜皱缩、细胞膜表面微绒毛显著减少甚至消失，胞浆浓缩，核糖体、线粒体等聚集在一起，细胞核均一固缩，染色质浓缩致密、呈向核膜下聚集。 结论 微重力可抑制BMSCs增殖、促进细胞凋亡，但适当浓度ICA可逆转微重力所引起的这种有害影响，对BMSCs起相应的保护作用。

[关键词] 骨髓间充质干细胞；淫羊藿苷；微重力；增殖；凋亡

[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）01（a）-0010-05

[Abstract] Objective To investigate the effect of icariin （ICA） on the proliferation and apoptosis of bone mesenchymal stem cell （BMSCs） under microgravity. Methods The BMSCs were randomly divided into three groups： microgravity group， dosing group and control group. The microgravity group and dosing group was treated with microgravity， besides， 1×10-6 mol/L ICA was applied to the cells in dosing group； the control group was cultured without any additional operation. Cell proliferation was detected by MTT assay， each group was set up 3 reduplicateholes； the apoptosis was detected by FCM， each group was detected 3 times； the expression of apoptosis related genes were detected by QPCR with 3 reduplicate holes， and the subcellular structure was observed by TEM. Results The result of MTT examination showed that the absorbance value of microgravity group was significantly lower than that of the control group （P < 0.01）， and the dosing group was significantly higher than that of the control group （P < 0.01）. FCM method showed that the apoptosis rate of microgravity group was significantly higher than control group （P < 0.01）， and the apoptosis rate of the dosing group was significantly lower than control group （P < 0.01）. Compared with the control group， the expression of Bcl-2， Bax/bcl-2， Bax， and P53 gene was up-regulated in microgravity group （all P < 0.05）； in dosing group， the expression of Bax， Bcl-2， P53 and the Bax/bcl-2 gene was significantly down-regulated when compared with microgravity group （all P < 0.01）. TEM indicated that the dosing group cells were generally normal and with no obvious changes when compared with the control group； in microgravity group， the cells existed membrane shrinking， microvilli decreasing， cytoplasmic concentration， ribosome and mitochondria gathering， nucleus pyknosis， and dense chromatin gathering to the margin of nuclear membrane. Conclusion Microgravity can inhibit osteoblast′s proliferation and promote apoptosis of BMSCs. But the appropriate concentration of ICA can protect BMSCs from the harmful effect caused by microgravity.

[Key words] Bone mesenchymal stem cell； Icariin； Microgravity； Proliferation； Apoptosis

淫羊藿又名洋火叶、弃杖草等，是小檗科多年生草本植物淫羊藿干燥茎叶，《中华人民共和国药典》2015版中记载其有“补肾阳，强筋骨，祛风湿”的功效[1]。研究表明，淫羊藿在骨损伤修复和抗骨质疏松治疗方面有着优良的生物活性[2]。现代中药药理学认为淫羊藿的主要有效成分是黄酮类化合物淫羊藿苷（icariin，ICA），其可调节内分泌与骨代谢，并改善心脑血管功能、免疫功能、性腺功能及抗肿瘤等。近年来研究发现，ICA可增强BMSCs的增殖活性和成骨活性，有效促进骨形成，对于骨损伤后的修复起重要作用[3-4]。然而，很少有研究集中在ICA与微重力刺激相结合时对BMSCs增殖与凋亡的影响。因此，本实验拟通过探讨ICA联合微重力对BMSCs增殖与凋亡的影响，为ICA治疗骨相关疾病提供更多的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

6周龄SPF级雄性SD大鼠5只，体重200～230 g，购自天津医科大学动物实验中心（动物合格证号：0042523），5只/笼，12 h光照/d，自由饮食，适应性喂养1周。

1.2 主要试剂与仪器

ICA（LCA-W-120602，北京中国药品生物制品检定所），Annexin V-FITC细胞凋亡试剂盒（C1063，江苏凯基生物技术股份有限公司），qPCR试剂盒（Cll7330 38，Invitogen，美国），小鼠抗CD44单克隆抗体（A3D8，Sigma，美国），小鼠抗CD45单克隆抗体（YY-1773R，Abcam，英国），平行平板旋转微重力效应模拟器（EQUL-3DR，NUNC，丹麦）；酶标仪（TECAN Infinite 200Pro，瑞士）；流式细胞仪（Bio-Plex200，Bio-Rad，美国），实时定量PCR仪（CFX96，Bio-Rad，美国）；透射电镜（HT7700，日立，日本）。

1.3 实验方法

1.3.1 SD大鼠BMSCs原代分离、培养、纯化及鉴定 取7周龄大鼠脱颈处死，无菌条件下取股骨和胫骨，按牟欢等[5]的方法分离培养BMSCs。采用流式细胞仪利用BMSCs表面分子标志物CD44、CD45鉴定BMSCs。

1.3.2 分组 取对数生长期（5×106/瓶）的第3代细胞常规消化，计数将1×105个BMSCs用移液枪接种至旋转平行平板腔，采用完全随机化分组方法分为对照组、微重力组、10 μg/L ICA和微重力组（加药组）。平板腔内加满培养基，注意避免产生气泡，培养24 h后更换培养基。将微重力组和加药组置于旋转模拟微重力效应器并放入培养箱使其在转速为10 r/min的条件下运转，连续4 d，每2天更换1次培养基，对照组同步置于培养箱中。

1.4 检测指标

1.4.1 MTT法检测细胞增殖 取实验各组细胞，每瓶加入2 mL MTT液，37℃避光孵育4 h，弃去液体，各瓶加入2 mL二甲基亚砜振荡15 min。每组细胞在96孔板上均设置3个复孔，每孔分别吸取200 μL，用酶标仪检测其在490 nm波长下的吸光度值。

1.4.2流式细胞术检测细胞凋亡 取实验各组细胞，胰蛋白酶消化，2000 r/min离心10 min，用1/15 mol/L PBS洗涤4次，重悬细胞计数至5×105，按试剂盒说明加入相关试剂，室温条件下避光孵育15 min；使用流式细胞仪上机检测，激发波长Ex=488 nm，发射波长Em=530 nm，每组重复3次。

1.4.3 qPCR检测mRNA表达 用Primier 5.0软件设计Bax、Bcl-2、P53、GAPDH引物（表1）。依说明书提取各组细胞总RNA，并反转录成cDNA。qPCR反应体系为25 μL，根据Nano Drop定量结果，体系中包含25 ng cDNA，各引物终浓度均为400 nmol/L。每一组的每种基因均设置3个复孔，反应条件均采用两步法：95℃ 3 min预变性，95℃ 15 s，60℃ 1 min，共40个循环；95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s，60℃ 15 s，行融解曲線分析，应用2-△△Ct法计算各基因的相对表达量。

1.4.4 透射电镜检测细胞亚细胞结构变化 取实验各组细胞，1/15 mol/L PBS洗涤，2000 r/min离心10 min，4%戊二醛固定12 h，4℃条件下送南开大学电镜室。按透射电镜制片步骤制片，完成后于透射电镜下观察。

1.5 统计学方法

采用SPSS 21.0统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较使用LSD法。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BMSCs生长特点及鉴定结果

原代BMSCs培养6～8 d后可见细胞呈梭形、纺锤形贴壁生长，形态逐渐趋向一致，在11～15 d后BMSCs基本融合铺满培养瓶呈典型的旋涡状生长或放射状生长。传代后BMSCs仍呈均一梭形贴壁生长，6～8 d基本达到融合状态。采用流式细胞术检测BMSCs表面抗原，显示CD44、CD45阳性细胞比率分别为98.96%、12.23%，符合BMSCs的鉴定标准[6]。见图1。

2.2 MTT法检测结果

微重力组吸光度值显著低于对照组[（1.65±0.03） vs. （2.14±0.04），P < 0.01]，加药组细胞吸光度值明显高于对照组和微重力组[（2.41±0.03） vs. （2.14±0.04），P < 0.01]。见图2。

2.3 流式细胞术检测结果

微重力组细胞凋亡率明显高于对照组[（0.116±0.004） vs. （0.046±0.002），P < 0.01]；加药组细胞凋亡率明显低于对照组[（0.027±0.002） vs. （0.046±0.002），P < 0.01]。见图3。

2.4 qPCR结果

微重力组P53、Bcl-2、Bax和Bax/Bcl-2的表达均较对照组明显升高（均P < 0.05）；加药组P53、Bcl-2、Bax和Bax/Bcl-2的表达均较微重力组显著降低（均P < 0.01）。见图4。

2.5 透射电镜亚细胞结构检测结果

透射电镜下观察亚细胞结构发现，加药组细胞形态大致正常，与对照组比较，未发生明显变化。微重力组部分细胞可见细胞膜皱缩、细胞膜表面微绒毛显著减少甚至消失，胞浆浓缩，核糖体、线粒体等聚集在一起，细胞核均一固缩，染色质浓缩致密、呈向核膜下聚集的趋势，呈早期凋亡现象（图5）。

3 讨论

随着我国太空探索活动越来越深入，太空微重力环境所致的骨量丢失是威胁航天员健康的主要问题之一[6]。骨代谢的平衡稳定主要取决于成骨细胞主导的骨生成与破骨细胞主导的骨吸收，而重力刺激和机械力学载荷则对其动态稳衡有着至关重要的调节作用[7]。研究证实，微重力所导致的骨量丢失主要是因为骨代谢平衡状态被打破，骨组织矿化障碍导致[8-9]。BMSCs起源于骨髓基质，成骨细胞则是由BMSCs在机体多种调控因素的调控下分化而来。近年来有学者研究证实微重力条件下BMSCs在形态、增殖及分化方面发生一系列变化[10-11]。ICA对骨生成和BMSCs的增殖与分化有着重要的调控作用[12]。本实验将ICA联合微重力来探索其对BMSCs增殖与凋亡的影响。

结果显示，微重力可抑制BMSCs增殖、诱导并激活BMSCs凋亡，加药组则可显著提高BMSCs活性并抑制BMSCs凋亡。黄国平等[13]研究发现微重力环境中BMSCs细胞周期停滞在G0/G1期，细胞增殖明显被抑制，在微重力环境中时间越长，这种现象愈明显，这可能是由于胞内游离状态的β-catenin mRNA含量降低导致经典Wnt信号转导通路被抑制所引起[14]。加入淫羊藿苷后，BMSCs增殖活性明显增高，与刘天麟等[15]研究结果类似，其以犬BMSCs为实验对象同样发现ICA对BMSCs增殖、骨向分化有促进作用。

透射电镜检测结果表明，微重力可诱导BMSCs凋亡，而加用ICA后，凋亡被显著抑制。这可能与ICA通过调控凋亡相关基因表达密切相关。Bax基因与Bcl-2基因是一对同源性较高但功能完全不同的同一家族成员。Bax基因过表达时可形成同源二聚体，促进细胞凋亡、抑制增殖；Bcl-2基因过表达时可与Bax基因形成异源二聚体，促进细胞增殖、抑制凋亡[16-18]。Bax基因和Bcl-2基因作为细胞凋亡正负向调控基因，两者的表达比（Bax/Bcl-2）不但决定细胞凋亡是否启动，还能反映凋亡的进展程度，对细胞凋亡的调控有着不可或缺的作用[19-20]。结果显示微重力可显著促进Bax表达，而应用ICA后Bax表达受到抑制，同时Bax/Bcl-2比值也显著降低，提示ICA对凋亡起到抑制作用。P53基因可与受损DNA结合，使细胞停滞在G1期而不能进入S期，并最终导致细胞凋亡[16-18]。ICA的应用，同样抑制P53的表达，从而发挥抗凋亡作用。

综上所述，微重力可抑制BMSCs增殖、促进BMSCs凋亡，但适当浓度（1×10-6 mol/L）的ICA能有效逆转微重力所引起的这种有害影响，对BMSCs起相应的保护作用。该研究可促进对ICA联合微重力因素对骨重建作用机制的了解，为临床骨保护药物的开发与应用提供理论依据，对临床治疗骨关节相关疾病具有重要意义。

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（收稿日期：2017-09-26 本文编辑：王 琼）