补肾通络颗粒对膝骨关节炎大鼠血清细胞因子及关节软骨含水率的影响

打开文本图片集

【摘 要】目的：观察补肾通络颗粒高、中、低剂量对膝骨关节炎大鼠血清白细胞介素（IL）-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平以及关节软骨含水率的影响。方法：将60只大鼠随机分为空白对照组，模型对照组，补肾通络颗粒高、中、低剂量组，美洛昔康组，每组10只。除空白对照组外，其余各组均予膝关节腔注射木瓜蛋白酶造模，并予药物干预后，用ELISA法测定大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α的水平，同时光镜下观察关节软骨并检测软骨含水率。结果：实验结束后，根据病理组织学检测发现模型对照组大鼠膝关节软骨退行性改变明显。与空白对照组比较，模型对照组膝骨关节炎大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平及关节软骨含水率均升高（P < 0.05）。与模型对照组比较，补肾通络颗粒高、中剂量组与美洛昔康组膝骨关节炎大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平均降低（P < 0.05），且补肾通络颗粒高、中剂量组关节软骨含水率亦较模型对照组降低（P < 0.05），而补肾通络颗粒低剂量组仅IL-1β、TNF-α水平低于模型对照组（P < 0.05）。与补肾通络颗粒低剂量组及美洛昔康组比较，补肾通络颗粒高剂量组膝骨关节炎大鼠血清IL-6水平及关节软骨含水率均降低（P < 0.05），补肾通络颗粒中剂量组仅关节软骨含水率降低（P < 0.05）。补肾通络颗粒高、中剂量组膝骨关节炎大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平及关节软骨含水率差异均无统计学意义（P > 0.05）。结论：补肾通络颗粒可能通过调节大鼠膝骨关节炎动物模型血清细胞因子水平及降低关节软骨含水率达到治疗作用，尤以中、高剂量组作用显著。

【关键词】 骨关节炎，膝；补肾通络颗粒；大鼠；细胞因子；软骨含水率

doi：10.3969/j.issn.2095-4174.2015.10.001

【ABSTRACT】Objective：To investigate the effect of Bushen Tongluo Granule （补肾通络颗粒） on the levels of IL-1β，IL-6 and TNF-α and water ratio of articular cartilage in rats with knee osteoarthritis.Methods：60 rats were randomly divided into a blank control group，a model control group，a high-dose Bushen Tongluo Granule group （HBTGG），a medium-dose Bushen Tongluo Granule group （MBTGG），a low-dose Bushen Tongluo Granule group （LBTGG），and a meloxicam group，10 rats in each group.Except for the blank control group，the other groups were modeled by injecting papain into joint cavity.After medicinal intervention，ELISA was used to measure the levels of IL-1β，IL-6 and TNF-α.At the same time，articular cartilage was observed and its water ratio was measured.Results：After experiment，the knee joint cartilage degeneration was obvious in the model group.

Compared with the blank control group，the levels of IL-1β，IL-6 and TNF-α and the water ratio of articular cartilage in the model group increased （P < 0.05）.Compared with the model control group，the levels of IL-1β，IL-6 and TNF-α in the HBTGG，MBTGG and the meloxicam group decreased （P < 0.05） and the water ratios of articular cartilage in the HBTGG and MBTGG were lower than those of the model control group （P < 0.05），and the levels of IL-1βand TNF-α in the LBTGG were lower than those of the model control group （P < 0.05）.Compared with the LBTGG and the meloxicam group，the level of IL-6 and the water ratio of articular cartilage of the HBTGG decreased significantly （P < 0.05） and the water ratio of articular cartilage of the MBTGG were lower （P < 0.05）.The differences of levels of IL-1，IL-6，TNF-α，and the water ratio of the articular cartilage between the HBTGG and MBTGG were not statistically significant （P > 0.05）.Conclusion：Bushen Tongluo Granule may treat knee osteoarthritis by regulating levels of serum cytokines and reducing water ratio of the articular cartilage，especially in the middle and high dose groups.

【Keywords】ostoarthritis，knee；Bushen Tongluo Granule（补肾通络颗粒）；rat；cytokine；water ratio of the articular cartilage

膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是一种以膝关节软骨退变和关节周围形成骨质增生为病理特征的关节炎，是最常见的一种慢性、进行性、致残性关节疾病。根据流行病学调查，我国KOA患病率在60岁以上人群可达50%，而75岁以上人群则高达80%[1-2]。目前现代医学对于KOA的治疗仍以口服非甾体类抗炎药，或关节腔注射透明质酸、激素，或关节镜、人工关节置换术等方式为主，虽具有一定的疗效，但不良反应较多，且花费高，均限制了在临床的长期运用。本病属中医学“骨痹”范畴，肾虚精亏瘀血阻络为其主要的病机，治疗上多以补肾通络为原则。补肾通络颗粒是本科室治疗KOA经验方，作为院内制剂在临床运用多年，其疗效明确，能改善关节症状并延缓病情进展，且无明显不良反应，价格低廉，适合长期使用。本实验以不同剂量补肾通络颗粒干预KOA大鼠动物模型，观测不同剂量补肾通络颗粒对KOA大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平及关节软骨含水率的影响，探讨其治疗KOA的作用机理，为临床更好地运用奠定基础。

1 实验材料

1.1 实验动物 SPF级健康Wistar大鼠60只，10周龄，体质量（180±20） g，雌雄各半，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，实验动物合格证号：SCXK（京）2006-0009。以上大鼠饲养地点为北京中医药大学屏障级动物房，许可证号：SYXK（京）2011-0024，饲养环境恒温、恒湿，所有大鼠均自由进食及水瓶给水。

1.2 实验试剂 木瓜蛋白酶（批号BRS009128），由MERCK公司提供；大鼠IL-1β（批号900-K86）、IL-6（批号900-M86）、TNF-α（批号900-M73）试剂盒，均由北京欣博盛生物科技有限公司提供。

1.3 实验药品 补肾通络颗粒，由本院中草药房提供，每剂含生药98 g；美洛昔康片（国药准字H20030679）每片7.5 mg，由江苏飞马药业提供。

1.4 实验设备 JD5000 1S电子天平（沈阳神宇龙腾天平有限公司）；Labofuge 400R离心机（Hearaeus公司）；MR-96A酶标仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）；LIBROR AEG-220G分析天平（日本SHIMADZU公司）；SL 101FAB-2型电热鼓风干燥箱（上海树立仪器仪表有限公司）；KL-I型组织自动脱水机（湖北康龙电子科技有限责任公司）；KH-BL生物组织包埋机（湖北孝感阔海医疗科技有限责任公司）；AD202-A轮转式切片机（上海珂淮仪器有限公司）；BX60光学显微镜（日本Olympus公司）。

2 方 法

2.1 动物分组 采用随机数表法，将60只Wistar大鼠分为空白对照组，模型对照组，补肾通络颗粒高、中、低剂量组，美洛昔康组，每组10只，雌雄各半。

2.2 造模方法 参照文献[3-4]，选用已经广泛报道且被反复证实的KOA动物模型经典造模方式：关节腔注射木瓜蛋白酶。除空白对照组外，其余各组大鼠分别于实验第1，4，7天膝关节腔内注射质量分数为4%木瓜蛋白酶生理盐水溶液各0.2 mL。

2.3 给药方法 采用灌胃给药法，用蒸馏水配置药物混悬液，连续给药4周。以60 kg成人为标准，参照人和动物间体表面积折算的等效剂量比率表换算，补肾通络颗粒高、中、低剂量组按20.58，10.29，5.15 g·kg-1给予补肾通络颗粒，美洛昔康组按0.787 5 mg·kg-1给予美洛昔康，空白对照组及模型对照组大鼠每日予蒸馏水灌胃。

2.4 观测指标检测

2.4.1 细胞因子检测 实验结束后，用10%水合氯醛（3 mL·kg-1）腹腔注射麻醉，麻醉成功后，从实验大鼠腹主动脉取血后处死大鼠。将取出的血常温下静置1 h后，用3000 r·min-1离心机离心10 min，离心后取上清液作为检测标本。采用ELISA法，按照大鼠IL-1β、IL-6、TNF-α试剂盒说明书操作，测定IL-1β、IL-6、TNF-α的OD值，并计算含量。

2.4.2 软骨含水率检测 采用分析天平，先称取软骨湿重，后将其置于鼓风加热机中，60 ℃加热12 h，再称取干重。含水率按以下公式计算：含水率=[（湿重-干重）/湿重]×100%。

2.4.3 病理组织学检测 采用HE染色法观察KOA大鼠膝关节软骨退变程度。打开关节腔后，尽快切取内侧胫骨平台中央条状关节面软骨片，按以下步骤进行：①常规脱蜡后用蒸馏水冲洗，并移入苏木精染液10～15 min；②用1%盐酸酒精分色后，镜下控制，至细胞核及核内染色质清晰为止；③流水冲洗并在碳酸锂饱和液中反蓝后移入0.5%伊红染液约5 min；④逐级经80%、90%、95%、100%各种浓度乙醇脱水；⑤石蜡包埋，切片机切片，中性树胶封片，光镜下观察关节软骨厚度、软骨面情况、软骨细胞数量等。

2.5 统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行统计分析。计量资料以表示，组间比较采用t检验，多组数据间比较采用单因素方差分析，方差齐则用LSD检验，方差不齐则用Games-Howell检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 大鼠KOA组织病理学 空白对照组软骨表面较为光滑，细胞排列规律且整齐，间质均匀。模型对照组可见糜烂的软骨面，细胞排列杂乱无规则，存在间质纤维化。美洛昔康组软骨面粗糙，软骨细胞排列紊乱，间质变性。补肾通络颗粒高剂量组软骨面尚光滑，软骨细胞排列不整，间质纤维化。补肾通络颗粒中剂量组可见粗糙的软骨面，细胞排列杂乱无规则，有反应性增生，存在间质纤维化。补肾通络颗粒低剂量组软骨变薄，细胞数量少，排列杂乱无规则，间质纤维化。见图1。

3.2 各组大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平比较 与空白对照组比较，模型对照组KOA大鼠血清3种细胞因子水平均升高（P < 0.05）。补肾通络颗粒高、中剂量组与美洛昔康组KOA大鼠血清3种细胞因子水平均低于模型对照组（P < 0.05），而补肾通络颗粒低剂量组仅IL-1β、TNF-α水平低于模型对照组（P < 0.05）。补肾通络颗粒高剂量组KOA大鼠血清IL-6水平低于补肾通络颗粒低剂量组及美洛昔康组（P < 0.05），而补肾通络颗粒中、高剂量组KOA大鼠血清3种细胞因子水平比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1。

3.3 各大鼠关节软骨含水率比较 与空白对照组比较，模型对照组KOA大鼠关节软骨含水率差异有统计学意义（P < 0.05）。与模型对照组、美洛昔康组、补肾通络颗粒低剂量组比较，补肾通络颗粒高、中剂量组KOA大鼠关节软骨含水率差异有统计学意义（P < 0.05）。补肾通络颗粒高、中剂量组KOA大鼠关节软骨含水率差异无统计学意义（P > 0.05）。见表2。

4 讨 论

目前用于大鼠诱导KOA的方式主要包括手术法及化学药物注射法[5]，其中膝关节腔注射药物被誉为建立KOA动物模型的经典方法，而木瓜蛋白酶是较为常用药物之一。已有研究表明，关节腔注射木瓜蛋白酶的造模方式成功率高、成型时间短[6]、重复性好，且具有与人类骨关节炎类似的特点[7]。早在20世纪70年代，国外学者就通过关节腔注射木瓜蛋白酶的方式成功建立了兔髋关节退行性关节炎动物模型。因此，在本项研究中，笔者也采用关节腔注射木瓜蛋白酶的方法建立大鼠KOA动物模型，实验结束后病理检查发现，与空白对照组比较，模型对照组大鼠膝关节软骨可见糜烂等KOA病理表现，也印证了膝关节腔注射木瓜蛋白酶的方法可建立稳定的大鼠KOA动物模型。

在已知的细胞因子中，IL-1β、IL-6、TNF-α是参与骨关节炎发病进程中的重要介质，是调节炎症的始动因素[8]。有研究显示，IL-1β可以与关节软骨细胞上相应受体结合，形成特殊的激素-受体复合物，通过cAMP、GTP等第二信使传达被改变的信息，影响关节软骨细胞的正常代谢活动。不少学者通过实验研究发现，关节IL-1β与软骨周围骨赘的形成密切相关[9]。IL-1β还影响与骨关节炎发病相关的细胞因子水平[10]，如有影响IL-1β可促进软骨细胞分泌前列腺素E2（PGE2），PGE2在关节炎症反应、成骨细胞样细胞增殖方面具有一定的作用。软骨的损伤与软骨糖蛋白的合成受到抑制，成纤维细胞合成增强有关，而这一过程IL-1β可通过介导IL-6而完成[11]。TNF-α既协同IL-1的作用，又可激活IL-6基因、诱导IL-6的生成，在骨关节炎的发生、发展中有可能起着决定性作用[12]。KOA的主要病理改变是关节软骨受到破坏，关节表面失去均质性，如发生中断、斑片凹陷、断裂，使软骨的可压缩性和弹性丧失[13]。研究表明，随着KOA在一定程度上的加重，关节软骨内含水量逐渐增加，如陈孟交等[14]认为，导致关节软骨含水量增加的原因可能与关节软骨蛋白多糖分解，使软骨内渗透压增高，从而导致水进入软骨内有关。也有学者认为，软骨内含水量增多可能与大量高能嗜水性糖蛋白分子团难以通过胶原纤维网架，使网架局限性遭到破损，带负电荷离子暴露增多有关[15]。

补肾通络颗粒是针对骨关节炎本虚标实的特点，以补肾治本为主，又兼顾其瘀血阻络的标象。全方主要由补骨脂、川牛膝、桑寄生、骨碎补、白芍等药物组成，中药药理学认为，上述药物不仅可提高超氧化物歧化酶（SOD）的活性，而且还可在一定程度上降低血清过氧化脂质的水平，进而可以保护生物膜，以达到改善软骨细胞功能，推迟细胞退行性变的目的，同时还对关节急性渗出性和增生性滑膜炎有一定的抑制作用。如补骨脂所含的补骨脂甲素、乙素、补骨脂定、补骨脂异黄酮等均有抗氧化作用，其中补骨脂甲素、乙素还能有效地清除氧自由基[16]。尚平等[17]则观察到骨碎补有显著的抗炎作用，而且止痛效果显著。而白芍有效成分白芍总苷能有效改善胶原性关节炎大鼠滑膜细胞超微结构的变化，并抑制其过度增殖反应和产生IL-1、干扰素和PGE2水平，从而对渗出性关节炎及滑膜炎均有一定的抑制作用[18]。

对于KOA的发病机制，目前研究认为除与软骨合成和分解代谢失调、机械磨损等因素有关外，滑膜炎已被公认为是KOA常见的重要特征之一[19]，其不仅是关节结构的破坏者，同时还可促进KOA的病情进展[20-21]。目前研究认为，在KOA发病早期，关节软骨退变尚不明显时，膝关节就已经存在不同程度的滑膜炎。究其原因，国内外大多数学者认为KOA的软骨病变可产生细小的碎软骨片，此类碎片落入滑液可激活滑膜内衬细胞，从而导致滑膜炎的出现。还有学者认为碱性磷酸钙或双水焦磷酸钙等晶体诱发的轻度炎症反应也是引起滑膜炎的潜在因素[22]。鉴于此，不少学者认为非甾体类抗炎药在KOA治疗中亦具有重要的作用。本项研究中，笔者选取美洛昔康作为西药对照药物，因其不仅具有较好的消炎止痛作用，且其属选择性环氧合酶-2抑制剂，临床不良反应较其他非甾体类抗炎药少。同时还有研究表明，美洛昔康对软骨基质蛋白聚糖的合成无不良影响，国内外已有众多临床使用美洛昔康治疗KOA的报道[23]。

本实验研究结果表明，与模型对照组比较，补肾通络颗粒高、中、低剂量组均可不同程度地降低大鼠KOA动物模型血清IL-1β、IL-6、TNF-α等细胞因子水平，其中补肾通络颗粒高、中剂量组对大鼠KOA动物模型血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平均有降低作用（P < 0.05），而补肾通络颗粒低剂量组仅能降低大鼠KOA动物模型血清IL-1β、TNF-α水平（P < 0.05）。结合补肾通络颗粒高、中剂量组还能降低大鼠KOA动物模型关节软骨含水率（P < 0.05），而补肾通络颗粒低剂量组则无此作用，提示补肾通络颗粒可能通过有效抑制炎症反应过程中相关炎性因子的释放及有效降低关节软骨含水率对大鼠KOA动物模型的治疗作用。而就不同剂量的补肾通络颗粒在降低大鼠KOA动物模型血清IL-1β、IL-6、TNF-α等细胞因子水平及关节软骨含水率方面具有一定的剂量依赖关系，即补肾通络颗粒高、中剂量优于低剂量，而在本项研究中，尚未发现补肾通络颗粒高、中剂量之间的疗效差异，可能与本项实验的动物模型数量偏少以及治疗周期较短有关，故补肾通络颗粒高、中剂量之间是否存在疗效差异有待于今后进一步研究。

5 参考文献

[1]中华医学会风湿病学分会.骨关节炎诊断及治疗指南[J].中华风湿病学杂志，2010，14（6）：416-419.

[2]中华中医药学会.骨性关节炎[J].风湿病与关节炎，2013，2（2）：71-72.

[3]韩冠英，凌沛学，王凤山，等.不同浓度木瓜蛋白酶建立兔膝骨关节炎模型的比较研究[J].中国骨伤，2012，25（5）：424-429.

[4]马玉峰，祁印泽，王庆甫，等.关节内注射药物建立骨性关节炎动物模型研究进展[J].中国骨伤，2015，28（1）：90-95.

[5]张立，王培民.膝骨关节炎动物模型的选择[J].世界中西医结合杂志，2014，9（7）：782-786.

[6]杨峰，史宗道.用木瓜蛋白酶建立兔颞颌关节骨关节炎模型的研究[J].华西口腔医学杂志，2002，20（5）：330-332.

[7]Aigner T，Cook JL，Gerwin N，et al.Histopathology atlas of animal model systems-overview of guidingprinciples[J].Osteoarthritis Cartilage，2010，18（Suppl 3）：S2-6.

[8]吴飞翔，张伟.白细胞介素在骨关节炎发病机制中的作用研究进展[J].中华临床医师杂志：电子版，2014，8（5）：975-978.

[9]黄金刚，童海骏，刘宏强，等.IL-1β和TNF-α对软骨细胞基质降解的影响及相关机制研究[J].上海交通大学学报：医学版，2010，30（9）：1084-1089.

[10]张建清.膝关节炎患者膝关节滑液中白细胞介素-1β白细胞介素-6含量变化的意义[J].实用医技杂志，2011，18（2）：127-128.

[11]罗玉明，郑维篷，魏合伟.骨关节炎与细胞因子TNF-α、IL-6关系的研究进展[J].现代诊断与治疗，2013，24（2）：326-327.

[12]Yuan PW，Liu DY，Chu XD，et al.Effects of preventive administration of juanbi capsules on TNF-alpha、IL-1 And IL-6 contents of joint fluid in the rabbit with knee osteoarthritis[J].J Tradit Chin Med，2010，30（4）：254-258.

[13]倪明，黄文伟.复方南星止痛膏治疗寒湿痹阻型膝骨性关节炎中医证候积分研究[J].湖南中医药大学学报，2009，29（9）：33-35.

[14]陈孟交，王桂蒙，肖四旺，等.丹紫康膝冲剂对兔膝骨关节炎软骨含水率及羟脯氨酸影响的研究[J].湖南中医药大学学报，2012，32（1）：20-22.

[15]钱善华，葛世荣.含水率对自然关节软骨压缩变形的影响[J].航天医学与医学工程，2010，23（2）：43-45.

[16]Guo JN，Weng XC，Wu H，et al.Antioxidants from a Chinese medicinal herb-Psoralea corylifolia L[J].Food Chenistry，2005，91（2）：287-292.

[17]尚平，贺宪，安耀武，等.骨碎补总黄酮对骨关节炎家兔骨髓间充质干细胞软骨定向分化的实验研究[J].生物骨科材料与临床研究，2009，6（6）：10-13.

[18]张利.白芍的药理作用及现代研究进展[J].中医临床研究，2014，6（29）：25-26.

[19]杨勐航，戴生明.滑膜炎在骨关节炎病情进展中的意义[J].中华风湿病学杂志，2010，14（7）：493-495.

[20]吕厚山，孙铁锋，刘忠厚.骨关节炎的诊治与研究进展[J].中国骨质疏松杂志，2004，10（1）：7-22，60.

[21]李兆福，彭江云，肖长虹，等.骨痹（骨关节炎）诊疗方案临床验证总结[J].风湿病与关节炎，2012，1（1）：16-21.

[22]Pritzker KP.Crystal deposition in joints：prevalence and relevance for arthritis[J].J Rheumatol，2008，35（6）：958-959.

[23]杨素平，陈锐.美洛昔康治疗骨关节炎的临床疗效[J].中国临床药学杂志，2004，13（1）：37-38.

收稿日期：2015-05-21；修回日期：2015-08-05