姜黄素对AD双转基因小鼠的Aβ产生神经保护作用的影响

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[摘要]目的：观察姜黄素对3月龄APPswe/PS1dE9双转基因小鼠干预6个月脑内Aβ40，Aβ42和Aβ42寡聚体-ADDLs的变化，探讨姜黄素的神经保护作用。方法：将APPswe/PS1dE9双转基因小鼠随机分为模型组、罗格列酮组（10 mg·kg^-1·d^-1）和姜黄素高、中、低剂量组（400，200，100 mg·kg^-1·d^-1），正常对照组采用的是同月龄同背景的C57/BL6J小鼠，于3月龄开始连续灌胃6个月，运用免疫组织化学方法和Western blot方法观察小鼠海马CA1区Aβ40，Aβ42和ADDLs的阳性细胞及分布和蛋白表达的变化。结果：免疫组织化学和Western blot方法均观察到模型组小鼠海马CA1区Aβ40，Aβ42和ADDLs阳性细胞数和蛋白表达均较对照组增加（P<0.01）。与模型组相比，免疫组化结果罗格列酮组与模型组相比均降低（P<0.05），Western blot见显著减低（P<0.01）；姜黄素高剂量组Aβ40，Aβ42和ADDLs阳性细胞数和蛋白表达均减少，中剂量组显著减少（P<0.01），低剂量组Aβ40和Aβ42蛋白表达也减少。结论：姜黄素连续干预6个月仍可以显著减少APPswe/PS1dE9双转基因小鼠脑内海马Aβ40，Aβ42和ADDLs的表达，姜黄素是否可以通过下调Aβ40，Aβ42和ADDLs的表达，影响Aβ级联反应，从而发挥神经保护，还需要更深入的研究。

[关键词]阿尔茨海默病；姜黄素；APPswe/PS1dE9双转基因小鼠；Aβ级联反应有关阿尔茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）的发病机制有很多观点，其中较为公认是Aβ级联反应假说。AD时，脑内的β淀粉样蛋白（β-amyloid，Aβ）生产和清除的失衡，在β和γ-分泌酶的作用下生成2种最主要的成分Aβ40和Aβ42，在特定条件下，在胞外聚集沉积形成老年斑^[1]，其中Aβ42易聚集，形成Aβ寡聚体或称ADDLs（Aβ-derived diffusible ligands），影响突触的结构和功能，从而导致记忆功能损害^[2]。ADDLs作为特异性高致病性配体，是引起AD病理改变的主要因素和中心环节，因而Aβ级联反应过程中的Aβ40，Aβ42和ADDLs是研究的热点。

中药单体姜黄素（curcumin）是从中药姜黄、莪术等根茎中提取的一种有效成分，具有多方面的药理作用^[3]。本文将研究姜黄素对9月龄AD模型小鼠脑内Aβ级联反应的影响，探讨其神经保护作用的机制。

1 材料

1.1 药品、试剂及仪器 姜黄素（美国Sigma-adrich公司，批号c138）；马来酸罗格列酮片（Rosiglitazone，RSG，天津葛兰素史克有限公司，批号09060108）；兔抗小鼠Aβ40和Aβ42抗体（稀释浓度1∶500，abcam公司）；兔抗小鼠ADDLs抗体（稀释浓度1∶5 000，millipore公司）；SABC免疫组化染色试剂盒、DAB显色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）；Mini-PROTEAN 3电泳仪（BIO-RAD公司）。

1.2 动物 3月龄APPswe/PS1dE9双转基因小鼠60只，同月龄同背景的C57/BL6J小鼠12只，购自中国医学科学院动物研究所，许可证号SCXK（京）2009-0004，饲养于北京中医药大学东直门医院中药药理学实验室屏障环境动物室[SYXK（京）2004-2009]。

2 方法

2.1 分组与给药 将3月的APPswe/PS1dE9双转基因小鼠随机分为5组：模型组、罗格列酮组、姜黄素高、中、低剂量组，每组12只，每日灌胃1次，连续6个月。正常对照组为同月龄同背景非转基因小鼠。对照组和模型组给予等体积0.5%羧甲基纤维素钠（CMC）灌胃；阳性对照组给予罗格列酮10 mg·kg^-1·d^-1灌胃；姜黄素组分别给予高、中、低剂量（400，200，100 mg·kg^-1·d^-1）姜黄素灌胃，实验过程中动物自由摄食和饮水。

2.2 取材及标本制备 Western-blot取材：每组6只，取新鲜组织，将小鼠断头处死，快速剥离海马，分别置于EP管中，液氮罐中储存备用。免疫组化取材：每组6只，灌注固定动物麻醉成功后，打开胸腹充分暴露心脏和肝脏。剪开左心尖部，插入灌注针头，同时剪开右心耳。快速灌注0.9%生理盐水，至肝脏完全变白右心室流出澄清液体后，改灌4%多聚甲醛固定液，先快后慢，至小鼠肝脏变硬肢体僵直，即完成固定。石蜡包埋灌注固定后断头，完整取出小鼠脑，投入4%多聚甲醛后固定液中，24 h后更换固定液1次，2～3 d后取材，将固定好的小鼠脑脱水、石蜡包埋。每只小鼠脑于海马CA1区出现后连续冠状切片，片厚4 μm。

2.3 免疫组织化学分析 采用Image-pro Plus图像分析系统采集图像和分析，记录每组阳性细胞数。

2.4 Western blot检测 蛋白质电泳、转膜、封闭、抗原抗体反应。用Image J分析软件分析各组Western blot条带整合灰度比例（integrated density，ID）与内参（β-actin）比较，得到相对百分数，即ID/内参ID×100%。

2.5 统计方法 所得数据以±s表示，采用统计软件SPSS 15.0进行统计分析，组间数据比较用单因素方差分析（One-way ANOVA）或非参数检验，P<0.05为有显著差异，P<0.01为有极显著差异。

3 结果

3.1 免疫组织化学染色观察姜黄素对APPswe/PS1dE9双转基因小鼠海马Aβ40，Aβ42和ADDLs阳性细胞数的影响 与对照组相比，模型组小鼠海马CA1区Aβ40，Aβ42和ADDLs阳性细胞明显增加（P<0.01）。与模型组相比，Aβ40阳性细胞数：姜黄素高剂量组小鼠有所减少（P<0.05），罗格列酮和姜黄素中剂量显著减少（P<0.01）。Aβ42阳性细胞数：姜黄素高、中剂量组阳性细胞数显著减少（P<0.01），罗格列酮和姜黄素低剂量组小鼠也有所减少（P<0.05）。ADDLs阳性细胞数：各治疗组小鼠阳性细胞都显著减少（P<0.01），见图1。

3.2 Western blot检测姜黄素对APPswe/PS1dE9双转基因小鼠海马Aβ40，Aβ42和ADDLs蛋白的表达 与对照组小鼠相比，Aβ40，Aβ42和ADDLs的模型组小鼠蛋白表达条带明显变粗，颜色变深，蛋白的表达增多（P<0.01）。与模型组小鼠相比：Aβ40的罗格列酮组、姜黄素高、中剂量组蛋白表达条带明显变细，颜色变浅，表明蛋白的表达减少（P<0.01），低剂量组也有所减少（P<0.05）；Aβ42各治疗组蛋白表达条带均明显变细，颜色变浅（P<0.01）；ADDLs的罗格列酮组、姜黄素中剂量组条带明显变细，蛋白表达减少（P<0.01），高剂量组也有所减少（P<0.05），见图2。

4 讨论

随着老龄化社会的到来，痴呆发病率的日益攀升，寻求能有效地预防和治疗AD的药物和方法越来越引起重视。正常情况下，脑内以Aβ40为主，而AD时以Aβ42为主^[4]。Aβ42是AD病理产物老年斑的主要成分，Aβ聚集成ADDLs寡聚体，释放和结合到特殊的部位，影响突触的结构和功能，从而导致记忆功能损害^[2]。

实验所采用的APPswe/PS1dE9双转基因小鼠是同时表达突变人β-淀粉样前体蛋白基因（β-amyloid precursor protein，APP）和突变早老蛋白（presinilinl，PSl）的双转基因小鼠，该小鼠可以较好的模拟AD的病因模型，可在短期内产生大量Aβ及ADDLs，6月龄时开始在大脑皮质、海马等区域形成大量淀粉样斑块，并且这些改变随年龄的增加逐渐加重^[5]。大量的研究证明罗格列酮可以降低ADDLs，改善AD小鼠认知功能的损害^[6-8]，因而阳性对照组选用的药物为罗格列酮。

课题组前期的大量研究发现姜黄素可以影响AD模型小鼠海马CA1区的AKT，p-AKT，PI3K，p-PI3K，IRS-1等蛋白表达，通过调节胰岛素信号转导机制发挥抗AD作用^[9-11]。还可以通过增加Aβ42降解酶NEP表达、降低Aβ42蛋白，进而改善小鼠的学习记忆能力^[12]。姜黄素自身结构使其能与Aβ结合，抑制有神经毒性的ADDLs的形成和延伸，使ADDLs中富含的β-折叠去稳定而重新形成Aβ单体，从而发挥抗淀粉样蛋白的作用^[13]。

课题组前期对姜黄素干预3个月研究结果发现能显著减少小鼠脑内Aβ40，Aβ42和ADDLs 的表达^[14]。为了进一步探讨姜黄素对不同的病理阶段的疗效，本研究对3月龄小鼠给药6个月的研究结果发现：免疫组化和Western blot的结果均显示模型组小鼠海马Aβ40，Aβ42和ADDLs的均较正常组增加（P<0.01），表明该小鼠模型能较好的模拟AD的病变。与模型组相比，罗格列酮组均明显减低；姜黄素高剂量组Aβ40，Aβ42和ADDLs阳性细胞数和蛋白表达均减少，中剂量组显著减少（P<0.01），低剂量组Aβ40和Aβ42蛋白表达也减少。姜黄素对干预6个月9月龄的APPswe/PS1dE9双转基因小鼠脑内的Aβ40，Aβ42和ADDLs均有减低，且不同剂量的姜黄素对Aβ42的作用更明显。由此可见姜黄素对AD模型小鼠6月龄时的早期病理阶段和9月龄时的晚期病理阶段均有改善作用。

AD的发病机制有很多，姜黄素降低Aβ40，Aβ42和ADDLs从而通过影响Aβ级联反应过程改善AD的症状，虽然得到了初步的验证，但是还需要更多的研究证实这一观点，开发预防和治疗AD的新药的任务仍然刻不容缓。

[参考文献]

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[10]党惠子，李瑞晟，王蓬文，等.姜黄素对APP/PS1双转基因小鼠海马PI3K及p-PI3K表达的影响[J].中国中药杂志， 2013，38（9）： 1295.

[11]冯慧利，王虹，王蓬文，等.姜黄素对APP/PS1双转基因小鼠海马IRS1和p-IRS1表达的影响[J].中国中药杂志， 2013，38（9）： 1290.

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[14]魏鹏，李瑞晟，王蓬文，等.姜黄素对APP/PS1双转基因小鼠Aβ及Aβ寡聚体表达的影响[J]. 北京中医药大学学报，2012，35（6）：386.

Neuroprotective effect of curcumin to Aβ of double transgenic

mice with Alzheimer′s disease

FENG Hui-li， FAN Hui， DANG Hui-zi， CHEN Xiao-pei， REN Ying， YANG Jin-duo， WANG Peng-wen *

（Tertiary Laboratory of State Administration of Traditional Chinese Medicine， Key Laboratory of Internal Medicine of

Traditional Chinese Medicine under Ministry of Education and Key Laboratory of Beijing， Laboratory of Pharmacology，

Dongzhimen Hospital， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100700， China）

[Abstract]Objective： To observe the changes in Aβ40，Aβ42 and ADDLs in brains of 3 month-old APPswe/PS1dE9 double transgenic mice after six-month intervention with curcumin， in order to discuss the neuroprotective effect of curcumin. Method： APPswe/PS1dE9dtg mice were randomly divided into the model group， the Rosiglitazone group （10 mg·kg^-1·d^-1） and curcumin high （400 mg·kg^-1·d^-1）， medium （200 mg·kg^-1·d^-1） and low （100 mg·kg^-1·d^-1） dosage groups， with C57/BL6J mice of the same age and the same background in the normal control group. After 6 months， the immunohistochemical staining （IHC） and the Western blot method were used to observe the changes in positive cell of Aβ40，Aβ42 and ADDLs in hippocampal CA1 area， their distribution and protein expressions. Result： Both of the immunohistochemical staining and the Western blot method showed more positive cell of Aβ40，Aβ42 and ADDLs in hippocampal CA1 area and higher protein expressions in the model group than the normal group （P<0.01）. IHC showed a lower result in the Rosiglitazone group than the model group （P<0.05）， while Western blot showed a much lower result （P<0.01）. The number of Aβ40，Aβ42 and ADDLs positive cells and the protein expressions decreased in the curcumin high group， the medium group showed a significant decrease （P<0.01）， and the low dose group also showed reductions in the protein expressions of Aβ40 and Aβ42. Conclusion： The six-month intervention with curcumin can significantly reduce the expressions of hippocampal Aβ40，Aβ42 and ADDLs in brains of APPswe/PS1dE9 double transgenic mice. Whether curcumin can impact Aβ cascade reaction by down-regulating expressions of Aβ40，Aβ42 and ADDLs and show the neuroprotective effect needs further studies.

[Key words] Alzheimer′s disease； curcumin； APPswe/PS1dE9 double transgenic mice； Aβ cascade reaction

doi：10.4268/cjcmm20141936

[责任编辑 张宁宁]