浙江省葡萄炭疽菌对甲基硫菌灵和戊唑醇的抗药性研究

陈聃　时浩杰等

摘 要：
【目的】了解浙江地区葡萄炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）对苯并咪唑类杀菌剂和甾醇脱甲基抑制剂（DMI）类杀菌剂的抗药性现状，为其防治提供依据和指导。【方法】采用区分剂量法测定了浙江省临安市、诸暨市和金华市的3个葡萄重要产区的108个葡萄炭疽病菌株对甲基硫菌灵和戊唑醇的抗药性，并对甲基硫菌灵敏感和抗药性菌株中的β-tubulin基因进行了扩增、测序和比较。【结果】所采集菌株群体对甲基硫菌灵的抗药性频率为37.04%，且均为高水平抗药性菌株（Ben HR），Ben HR对多菌灵和乙霉威表现双重抗药性，其β-tubulin基因的第200位密码子从TTC突变为TAC，导致第200位氨基酸从苯丙氨酸（Phe）突变为络氨酸（Tyr）。所采集菌株群体共检测到33个（30.56%）对戊唑醇表现低水平抗药性的菌株。【结论】浙江地区葡萄炭疽病菌对甲基硫菌灵、乙霉威产生了严重的抗药性，对DMIs类杀菌剂戊唑醇的抗药性发展迅速。

关键词：
葡萄炭疽病菌；

甲基硫菌灵；

乙霉威；

戊唑醇；

抗药性；

β-tubulin基因

中图分类号：S663.1 文献标志码：A 文章编号：1009-9980？穴2013？雪04-0665-04

葡萄是我国重要的果树，近10年栽培面积和产量一直呈上升趋势[1]。浙江省地理位置优越，葡萄产业发展迅速，到2010年，全省已有葡萄栽培面积2万hm2以上。葡萄作为重要的果树经济作物，已成为浙江省农民增收的重要渠道。

葡萄炭疽病是葡萄上重要的真菌病害之一。胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides （Penz.） Sacc.）是引起该病的病原菌之一，有性世代属于子囊菌亚门，子囊菌纲，球壳菌目，小丛壳属的围小丛壳菌（Glomerel ciagulata （Ston） Spauld et schrenk），自然条件下罕见[2]。胶孢炭疽菌的寄主广泛，不同的专化型可以侵染多种不同的作物，如香蕉、杧果、辣椒、草莓、苹果、桃等[2-6]，且因与寄主之间协同进化和受环境影响如农药等因素的作用，产生的变异相对较多，也较快。因此，对这些变化的跟踪和研究也非常有必要，国内外也有很多相关研究[4]。

目前生产上用于葡萄炭疽病防治的主要药剂有苯并咪唑类的多菌灵和甲基硫菌灵，甾醇脱甲基抑制剂类（DMIs）的戊唑醇和咪鲜胺等。国内外在很多种致病真菌上已有关于对苯并咪唑类杀菌剂产生抗药性的报道，如小麦赤霉病菌（Fusarium graminearum）[7-8]和灰霉病菌（Botrytis cinerea）[9]。国内，叶佳等[10]报道的浙江省葡萄炭疽病菌已对甲基硫菌灵产生了严重的抗药性，但具体抗性机制还不清楚。叶佳等[9]报道浙江省葡萄炭疽病菌已对戊唑醇出现了敏感性分化，但进一步的发展情况还有待研究。

本研究定性测定了从浙江省葡萄重要产区采集的108株葡萄炭疽病菌株对甲基硫菌灵、多菌灵·乙霉威和戊唑醇的敏感性，并研究了葡萄上胶孢炭疽菌的对甲基硫菌灵的抗性分子机制。

1 材料和方法

1.1 菌株的采集、分离和鉴定

1.2 供试药剂

1.3 对甲基硫菌灵的抗药性检测

1.4 甲基硫菌灵抗性菌株对多菌灵·乙霉威的双重抗药性测定

1.5 葡萄炭疽病菌β-tubulin基因序列的扩增和测序

选取对甲基硫菌灵的敏感性菌株和抗性菌株各4株，在PDA培养基上于25 ℃黑暗条件下培养7 d后，用灭过菌的载玻片刮取菌丝，放入灭过菌的研钵中。在研钵中加入适量液氮并研磨成粉末状。DNA提取采用真菌基因组DNA快速抽提取试剂盒（SK2082）（上海生工）。引物序列根据已经报道的引物序列，TubGF（5-TCTCGATGT-TATCCGCCG-3），TubGR （5-TGAGCTCAGGAACACTGACG-3） [11]，由上海生工生物合成。PCR扩增采用即用PCR扩增试剂盒（上海生工）。PCR 参数为94 ℃预变性5 min，然后经94 ℃变性60 s，54 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，循环35次，最后 72 ℃延伸5 min[11]。PCR产物经电泳，割胶纯化回收后，直接送上海生工测定，结果用软件进行数据处理。

1.6 对DMI类杀菌剂戊唑醇的抗药性检测

2 结果与分析

2.1 葡萄炭疽病菌对甲基硫菌灵的抗药性频率

2.2 对多菌灵和乙霉威的双重抗药性

2.4 葡萄炭疽病菌对戊唑醇的抗药性频率

3 讨 论

对苯并咪唑类杀菌剂的抗药性菌株主要有两种类型：
Ben R1和Ben R2。在苯并咪唑类杀菌剂使用以前，田间菌株为Ben S，Ben S菌株对苯并咪唑类杀菌剂敏感、同时对乙霉威表现抗药性（二者之间存在负交互抗药性）；
苯并咪唑类杀菌剂大量连续使用以后，田间开始出现Ben R1菌株。Ben R1对苯并咪唑类杀菌剂表现为高水平抗药性，但对乙霉威敏感。于是多菌灵和乙霉威的复配制剂被大量用于对Ben R1的治理，田间开始出现Ben R2菌株[12-13]。Ben R2菌株表现为抗苯并咪唑类杀菌剂，同时对乙霉威表现抗药性，即双重抗药性菌株[12]。

本研究检测了浙江省葡萄产区临安、诸暨和金华3地葡萄炭疽菌群体对苯并咪唑类杀菌剂甲基硫菌灵的抗药性。从研究结果看，以上三地的葡萄炭疽病菌已对甲基硫菌灵产生了较严重的抗药性，抗性频率37.04%。胶孢炭疽菌对苯并咪唑类杀菌剂的高频率抗性会导致苯并咪唑类杀菌剂对葡萄炭疽病的防治效果下降[14-15]。鉴于多菌灵和甲基硫菌灵有正交互抗性，因此认为这三个地区在葡萄上应减少使用苯并咪唑类药剂。并且此类菌株对多菌灵·乙霉威也产生了抗性，即为双重抗药性菌株。说明临安、诸暨和金华3地的葡萄炭疽菌群体对咪唑类杀菌剂已产生Ben R2抗性类型。

供试菌株中30.56%对戊唑醇产生低水平抗药性，这与叶佳等[9]2011年采集的浙江省78个葡萄炭疽病菌株中2个菌株对戊唑醇的敏感性明显较低的报道相比，抗性水平迅速提高，敏感性分化更为明显，说明在浙江省此类药剂的抗性发展较快，因此为延缓对戊唑醇抗药性的产生[15]，笔者建议使用不同作用位点的杀菌剂与对此类药剂混用或交替使用。

4 结 论

浙江省临安、诸暨等地区葡萄炭疽病菌已对甲基硫菌灵、乙霉威产生了较为严重的抗药性，抗性机制为β-Tubulin基因密码子第200位苯丙氨酸（Phe）变为络氨酸（Tyr），建议该地区减少使用这两类杀菌剂，否则会因用量过大造成环境污染；
与之前报道相比，浙江省葡萄炭疽病菌对戊唑醇的抗药性水平发展迅速，建议生产中尽量避免此类药剂单一，以延缓对此类杀菌剂抗药性的产生。

参考文献 References：

[1] LI Hua， FANG Yu-lin. Study on the mode of sustainable viticulture：
Quality， Stability， Longevity and Beauty[J]. Science Technology， 2005， 23（9）：
20-22.

李华，房玉林. 论葡萄产业可持续发展模式的目标—优质、稳产、长寿、美观[J]. 科技导报，2005，23（9）：
20-22.

[2] LI Yang. Study on carbendazim-resistant Colletotrichum gloeosporioides （Penz.） Sacc. in Liaoning[D]. Lanzhou：
Gansu Agricultural University， 2009.

李洋. 辽宁葡萄炭疽病菌对多菌灵抗药性研究[D]. 兰州：
甘肃农业大学，2009.

[3] KEFIALEW Y， AYALEW A. Postharvest biological control of anthracnose （Colletotrichum gloeosporioides） on mango （Mangifera indica）[J]. Postharvest Biology and Technology， 2008（50）：
8-11.

[4] THAN P，JEEWON R，HYDE K D，PONGSUPASAMIT S，MINGKOLPORN O， TAYLOR P W J. Characterization and pathogenicity of Colletotrichum species associated with anthracnose on chilli （Capsicum spp.） in Thailand[J]. Plant Pathology， 2008（57）：
562-572.

[5] BERNSTEIN B， ZEHR E I， DEAN R A， SHABI E. Characteristics of Colletotrichum from peach， apple， pecan， and other hosts[J]. Plant Disease，1995， 79：
478-482.

[6] MAYMON M， ZVEIBIL A， PIVONIA S， MINZ D， FREEMAN S. Identification and characterization of benomyl-resistant and-sensitive populations of Colletotrichum gloeosporioides from Statice （Limonium spp.）[J]. Phytopathology， 2006， 96：
542-548.

[7] LU Yue-jian， ZHOU Ming-guo， YE Zhong-yin， HOLLOMON D W， Butters J A. Cloningg and characterization of β-tubulin gene fragment from carbendazim resistance stirain of Fusarium gramineamm[J]. Acta Phytopathologica Sinica， 2000， 30（1）：
30-34.

陆悦健，周明国，叶钟音，Hollomon D W，BUTTERS J A. 抗苯并咪唑的小麦赤霉病菌β-tubulin 基因序列分析与特性研究[J]. 植物病理学报，2000，30（1）：
30-34.

[8] LI Hong-xia， LU Yue-jian， WANG Jian-xin， ZHOU Ming-guo. Comparisonof mutations in the β-tubulin gene that confer resistance to carbendazimin four plant pathogenic fungi[J]. Journal of Nanjing Agricultural University， 2002， 25 （3）：
41- 44.

李红霞，陆悦健，王建新，周明国. 四种不同植物病原真菌与多菌灵抗药性相关基因突变的比较[J]. 南京农业大学学报，2002，25 （3）：
41- 44.

[9] YE Jia， ZHANG Chuan-qing. Detection of sensitivity of grape anthracnose to thiophanate methyl， tebuconazole and kresoxim-methyl[J]. Chinese Journal of Pesticide Sciences， 2012，14（1）：
111-114.

叶佳，张传清. 葡萄炭疽病菌对甲基硫菌灵、戊唑醇和醚菌酯的敏感性检测[J]. 农药学学报，2012，14（1）：
111-114.

[10] ZHANG Chuan-qing， ZHANG Ya， WEI Fang-lin， LIU Shao-ying， ZHU Guo-nian. Detection of resistance of Botryotinia fuckeliana from protected vegetables to different classes of fungicides[J]. Chinese Journal of Pesticide Sciences， 2006， 8（3）：
245-249.

张传清，张雅，魏方林，刘少颖，朱国念. 设施蔬菜灰霉病菌对不同类型杀菌剂的抗性检测[J]. 农药学学报，2006，8（3）：
245-249.

[11] CHUNG Wen-hsin， CHUNG Wen-chuan， PENG Mun-tsu， Hong-Ren-yang， HUANG Jenn-wen. Specific detection of benzimidazole resistance in Colletotrichum gloeosporioides from fruit crops by PCR-RFLP[J]. N Biotechnol， 2010， 27（1）：
17-24.

[12] ZHANG C Q， LIU Y H， ZHU G N. Detection and characterization of benzimidazole resistance of Botrytis cinerea in greenhouse vegetables[J]. European Journal of Plant Pathology， 2010，126， 509-515.

[13] YOUNG J R， TOMASO-PETERSON M. Two Mutations in β-Tubulin 2 Gene Associated with Thiophanate-Methyl Resistance in Colletotrichum cereale Isolates from Creeping Bentgrass in Mississippi and Alabama[J]. Plant Disease，2010，94：
207-212.

[14] MACKENZIE S J， MERTELY J C， PERES N A. Curative and protectant activity of fungicides for control of crown rot of strawberry caused by Colletotrichum gloeosporioides[J]. Plant Disease，2009，93（8）：
815-820.

[15] DENG Wei-ping， YANG Min， DU Fei， LIU Yi-xiang， ZHANG Li-tao， YAN Ying-ying， WANG Si-qi， YANG Ji-zhong， HE Xia-hong， ZHU Shu-sheng. Sensitivity of Colletotrichum gloeosporioides causing grape anthracnose to three sterol demethylation inhibitor （DMI） fungicides[J]. Chinese Journal of Pesticide Sciences， 2011， 13（3）：
245-252.

邓维平，杨敏，杜飞，刘屹湘，张丽韬，闫莹莹，汪思齐，杨积忠，何霞红，朱书生. 葡萄胶孢炭疽菌对3种麦角甾醇脱甲基抑制剂类杀菌剂的敏感性[J]. 农药学学报，2011，13（3）：
245-252.