UPLC测定草莓果实中类胡萝卜素含量

陈敏氡　朱海生等

摘 要：
【目的】为了获得适宜进行草莓果实类胡萝卜素各组分定性定量分析的方法，【方法】以成熟草莓果实为材料，通过对不同提取剂、提取方法的筛选，优化草莓果实类胡萝卜素的提取条件；
通过确定色谱条件以及重复性、精密度、回收率试验，建立类胡萝卜素超高效液相色谱法标准分析体系。【结果】以丙酮∶石油醚=1∶2作为提取剂，皂化提取草莓果实中类胡萝卜素，同时采用ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱，以乙腈∶甲醇=9∶1为流动相，在450 nm下测定是进行草莓果实类胡萝卜素定性定量分析的最佳方法。成熟草莓中能检测到叶黄素、β-隐黄质、β-胡萝卜素，含量依次为：118.5、12.6、99.8 μg·kg-1；
检测不到番茄红素；
检测可以在5 min内完成，比常规方法节约时间70%左右；
方法平均回收率达到93.2%，变异系数为1.32%～1.86%。【结论】提取方法和超高效液相色谱法标准分析体系适合草莓果实类胡萝卜素各组分的定性定量分析。

关键词：
草莓；

类胡萝卜素；

高效液相色谱法（UPLC）

中图分类号：S668.4 文献标志码：A 文章编号：1009-9980？穴2013？雪04-0706-06

草莓（Fragaria ananassa Duch.）属蔷薇科多年生草本植物，果实鲜美红嫩，浓郁多汁，果味芳香并且营养丰富，素有“水果皇后”之称。近年来，随着草莓经济价值的日益走俏，人们开始越来越重视草莓的果实品质。类胡萝卜素既是决定水果、蔬菜内在营养品质的重要指标，也是影响果实外观品质和花卉观赏价值的重要因素[1]。越来越多的医学研究表明，除了β-胡萝卜素是维生素A的前体外，许多类胡萝卜素在猝灭自由基、增强人体免疫力、预防心血管疾病和防癌抗癌等保护人类健康方面起着重要的作用[2-3]。目前草莓类胡萝卜素种类和含量测定尚未见报道，缺少准确可靠的检测方法，因此建立一种快速、准确的测定方法对合理开发和利用我国草莓资源具有重要的理论价值和应用前景。

检测植物中类胡萝卜素的方法有纸层析法、柱层析法、薄层层析法、膜层析法和高效液相色谱法[4]。超高效液相色谱（Ultra performance liquid chromatography， UPLC）是近几年推出的一种新的液相色谱技术，相较于传统的分析方法带来的分辨率限制、操作繁杂、无法检测到更多种类的类胡萝卜素的缺点，UPLC以更短的填料色谱柱，耐受超高压（40 Mpa）色谱泵和色谱系统，使分离速度、灵敏度、分离度达到普通HPLC的9、3、1.7倍，体现出明显的超高选择性、超高分离度、超高灵敏度以及超高速等优势，在蛋白组学、药物分析、环境监测等众多高端领域得到应用[5-6]，利用UPLC测定分析类胡萝卜素仅在番茄制品等食品上有过报道[7]。利用UPLC测定分析类胡萝卜素在草莓上属首次。本试验通过筛选草莓果实类胡萝卜素的提取条件，来优化提取方法；
同时利用UPLC对草莓果实类胡萝卜素各个成分进行测定和分析，建立适合草莓果实类胡萝卜素定性和定量分析的最佳方法，为今后进一步研究草莓果实类胡萝卜素积累规律提供技术基础。

1 材料和方法

1.1 材料

草莓品种为‘法兰地，采后直接置于-70 ℃冷冻保存待测。

1.2 试剂

1.3 仪器

1.4 方法

1.4.1 草莓类胡萝卜素的提取 1）浸提。将成熟的草莓果肉置于预冷的研钵中，用液氮快速研磨至粉末状，准确称取5 g，加入20 mL浸提剂于50 ℃，避光浸提3 h，过滤收集浸提液，重复操作至残渣发白，合并浸提液，定容至50 mL，备用。

2）萃取。采用未经皂化和皂化2种处理方法萃取果实中类胡萝卜素，重复试验3次，在波长450 nm下，用紫外分光光度计测定吸光度A。

2）确定UPLC色谱条件。筛选适宜流动相及其他色谱条件。

3）重复性、精密度试验。取4种类胡萝卜素标准品，重复进样5次，分别计算保留时间和峰面积的平均值、标准差和变异系数，来测定仪器的重复性以及方法的精密性。

4）回收率试验。用液氮将草莓果实研磨成粉，平均分成5份，其中4份分别加入20 μg 4种标准品，剩下1份不加入标准品，作为空白对照。按前述的草莓果实类胡萝卜素提取方法进行提取，测定5份样品的类胡萝卜素含量，计算类胡萝卜素的回收率，同样试验条件下平行测定3次。

1.4.3 草莓类胡萝卜素总量及不同组分含量的测定

类胡萝卜素总量参照《GB/12291-1990水果、蔬菜汁类胡萝卜素全量的测定方法》[8]，利用紫外分光光度计测定。类胡萝卜素各组分及其含量利用UPLC标准体系进行检测，上机前用流动相进行稀释，经0.22 μm微孔过滤膜过滤。

2 结果与分析

2.1 草莓果实类胡萝卜素最佳提取条件的筛选

2.2 类胡萝卜素UPLC标准体系的建立

2.3 草莓果实中类胡萝卜素成分及其含量的测定

3 讨 论

类胡萝卜素的提取溶剂很多，但由于试验样品的多样性以及类胡萝卜素种类的繁多性，使得没有一种溶剂能适合所有样品中类胡萝卜素的提取[9]。在辣椒中以叶黄素类作为主要提取物时，乙醇是较好的有机溶剂；
在番茄汁中以番茄红素为主要提取物时，乙醇和正己烷混合是较好的有机溶剂[10]；
在桃中以β-胡萝卜素为主要提取物时，丙酮是较好的有机溶剂[11]。因此，为了提高提取效率，应该针对草莓筛选出最佳的提取剂。本试验采用7种有机溶剂或组合对草莓果实进行浸提，结果表明在草莓果实中以叶黄素和β-胡萝卜素为主要提取物时，丙酮∶石油醚=1∶2（各自含0.1%BHT）是最佳的提取剂。

蔬菜、 水果中的类胡萝卜素主要以脂肪酸酯的形式存在， 其酯化程度依叶黄素中羟基数目的多少而变化[12]。因此，在提取时常常对材料进行皂化处理，旨在水解类胡萝卜素酯，得到游离态类胡萝卜素单体，同时除去叶绿素干扰，达到简化分离准确定量的目的[13]。然而皂化的同时会导致类胡萝卜素总量或单个类胡萝卜素的降解损失，这种损失取决于皂化的条件和样品的成分[14-15]。沙棘[16]、柑橘[13]等在类胡萝卜素提取过程中经皂化处理，取得较好效果，而在桃类[11]、苹果[17]等胡萝卜素提取过程中，不经过皂化处理的方法较合适。本试验结果表明皂化处理可以明显提高草莓果实中类胡萝卜素的提取效果。

近年来，类胡萝卜素测定方法主要有分光光度法[18]、薄层色谱法（TLC）[19]、柱层析法[20]、高效液相色谱法（HPLC）[21]等。其中分光光度法常用于测定纯类胡萝卜素的量或浓度，或用来估算混合物或天然萃取物中的总类胡萝卜素含量，然而这种方法不能排除样品中其他类胡萝卜素的干扰，定量不准确，精确度相对较低[11，22]。薄层色谱法具有操作简便、快速等特点，比较多的用于定性分析，但也不易定量[11，22]；
高效液相色谱法具有高柱效、高选择性、高灵敏度、分析速度快等优点，但分析时间长，有的还无法将某些类胡萝卜素分开[7]。超高效液相色谱法不仅保有高效液相色谱法的优点，而且还很好的克服了分析时间长的弊端，相较于HPLC法检测类胡萝卜素要20 min左右，UPLC在5 min内就可以完成检测，节约时间70%左右。此外，本试验采用超高效液相色谱法，只以乙腈∶甲醇=9∶1（v/v） 为流动相，无需梯度洗脱同时避免使用二氯甲烷，就将4个标准样品彻底分离，方法简便，安全。

利用草莓UPLC类胡萝卜素标准分析体系，在草莓果实中检测到叶黄素、β-胡萝卜素和β-隐黄质，含量依次为118.5、99.8、12.6 μg·kg-1，类胡萝卜素总含量为428.1 μg·kg-1，没有检测到番茄红素，推测此结果与品种本身差异有关。研究表明不同的蔬菜，水果含有的类胡萝卜素的成分和含量差异较大，且较单一。如万寿菊、菠菜、羽衣甘蓝主要以叶黄素为主，番茄以番茄红素为主，而绿叶蔬菜却以胡萝卜素为主[23-24]。综上所述，成熟的草莓果实中含有叶黄素、β-胡萝卜素和β-隐黄质，其中叶黄素含量最高，β-胡萝卜素次之，β-隐黄质含量最少。本试验建立了草莓类胡萝卜素超高效液相色谱法标准分析体系， 在成熟草莓中检测到叶黄素、β-隐黄质、β-胡萝卜素，检测不到番茄红素，方法简单快速、重现性好，适合于草莓果实类胡萝卜素定性定量分析。

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