二十碳五烯酸抑制肺腺癌A-549细胞株增殖_二十碳五烯酸

　　[摘要] 目的 在体外细胞实验中，观察二十碳五烯酸（EPA）联合顺铂（DDP）对肺腺癌A-549细胞株的抗增殖和诱导凋亡作用。方法 选用A-549细胞株进行体外培养，用MTT比色法测定EPA对A-549细胞株的抗增殖作用。应用倒置显微镜、光学显微镜观察细胞凋亡形态学变化。应用TUNEL染色法检测细胞凋亡指数（AI）。结果 实验结果表明，EPA在（60～120）μg/mL浓度范围内，于24、48、72、96h四个时间段对肺腺癌A-549细胞株均有抑制生长作用，且EPA与顺铂有协同抗癌作用，并表现出浓度、时间依赖性关系。当EPA浓度为60、80、100、120μg/mL时，细胞凋亡指数（AI）依次升高，分别为（81.52±1.96）%、（83.74±2.21）%、（85.30±2.38）%、（86.26±2.44）%，不同浓度组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 体外实验中，EPA对A-549细胞生长有抑制作用，呈明显的量效和时效关系，且与顺铂有协同作用。
　　[关键词] 二十碳五烯酸；增殖；肺腺癌；A-549细胞株
　　[中图分类号] R734.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2011）23-07-03
　　
　　The Effect of Inhibiting Hyperplasia of Eicosapentaenoic Acid on A-549 Human Lung Cancer Cell Line
　　MA Liujiang AN Jinghua LI Xing SHI Jun
　　The Affiliated Hospital of Yanbian University, Yanji 133000, China
　　
　　[Abstract] Objective To observe the effects of anti-proliferation and inducing apoptosis on A-549 cell line induced by eicosapentaenoic acid （EPA） and its synergistic effect with cisplatin （DDP） in vitro. Methods A-549 cell line was cultured in vitro. MTT assay was used to determine the growth inhibitory effect of EPA on A-549 cells. Morphological changes of the apoptosis of A-549 cells were observed by using inverted microscope. TUNEL was used to detect cell cycle distribution and apoptotic rate of A-549 cells. Results The results of experiments showed that when A-549 cells were exposed to EPA for 24h, 48h, 72h and 96h respectively at final concentration of （60-120） μg/mL, the growth of cells was inhibited and showed in dose and time dependent manner. EPA combined with DDP showed significant synergistic anti-tumor effect on A-549 cells. When the concentration of EPA altered from 60μg/mL to 120μg/mL, the apoptotic index （AI） of A-549 cells elevated accordingly by the method of terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling （TUNEL）, the apoptotic indexes were （81.52±1.96）%, （83.74±2.21）%, （85.30±2.38）%, （86.26±2.44）% respectively and showed statistical significance compared between different concentration （P＜0.05）. Conclusion EPA inhibits growth of A-549 cell line in vitro in dose and time dependent manner; EPA combined with DDP shows significant synergistic anti-tumor effect on A-549 cell line.
　　[Key words] Eicosapentaenoic acid; Hyperplasia; Lung adenocarcinoma; A-549 cell line
　　
　　目前各种肿瘤已成为威胁人类健康的第一位死因[1，2]，并且肿瘤的发病有逐年增加和年轻化的趋势。在已经完成的研究中表明，肿瘤细胞与正常组织细胞在脂质代谢有本质区别，肿瘤细胞质中可出现糖脂减少等[1，3-6]。因此，在肿瘤的治疗中，可以利用不饱和脂肪酸作为探针，联合抗肿瘤药物来进行抗肿瘤治疗。2008～2010年我们应用ω-3不饱和脂肪酸中的二十碳五烯酸（EPA）联合顺铂（DDP）共同作用于肺腺癌A-549细胞株，继续观察更大剂量的EPA联合顺铂对肺腺癌A-549细胞株的影响及可能的作用机制和靶点。
　　1 材料与方法
　　1.1 实验材料
　　人肺腺癌A-549细胞株（购自上海百谊生物科技有限公司），EPA，顺铂，噻唑蓝（MTT），无支原体胎牛血清，RPMI-1640培养液，TUNEL试剂，胰蛋白酶等。
　　1.2 细胞培养与分组
　　细胞实验培养方法参考文献[7，8]。①细胞培养：肺腺癌A-549细胞解冻后，用RPMI-1640培养液置于CO2培养箱培养，用0.25%胰蛋白酶消化传代。0.4%台盼蓝鉴定细胞活性98%以上时做实验[9]。②细胞分组：A组：加完全培养液50μL；B组：在A组基础上加EPA 60μg/mL（B1组）、EPA 80μg/mL（B2组）、EPA 100μg/mL（B3组）、EPA 120μg/mL（B4组）、顺铂30μg/mL（B5组）、顺铂30μg/mL+EPA 60μg/mL（B6组）、顺铂30μg/mL+EPA 80μg/mL（B7组）、顺铂30μg/mL+EPA 100μg/mL（B8组）、顺铂30μg/mL+EPA 120μg/mL（B9组）。各组分别培养并在24、48、72和96h时观察。
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　　①形态学观察：PBS洗涤，95%乙醇固定，常规HE染色，观察细胞形态变化[9]。②细胞生长抑制率计算：采用MTT法测定各组细胞的生长抑制情况[10，11]。计算各组细胞生长抑制率及药物半数抑制浓度（IC50）。③细胞凋亡指数（AI）：细胞用4%多聚甲醛固定后，用TUNEL法检测各组细胞凋亡情况。随机选取10个高倍视野，分别计数细胞总数及凋亡细胞数。AI＝凋亡细胞数/细胞总数×100%。
　　1.4 流式细胞术检测
　　取对数生长期细胞，置入培养瓶中，贴壁后分别加入各组药物，48h后用Annexin V-FITC和溴化丙啶（propidium iodide，PI）后上机检测。
　　1.5 统计学处理
　　采用SPSS17.0统计软件对数据进行单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。
　　2 结果
　　2.1 各组A-549细胞形态
　　光镜下，A组细胞生长旺盛，核分裂多见，核质染色均匀；B组细胞缩小，核质浓缩，部分细胞凋亡。倒置显微镜下，A组细胞贴壁生长良好，透光度佳；B组细胞变小，染色质凝集，透亮度差，贴壁能力差，生长明显受抑。见图1～4。
　　2.2 各组A-549细胞生长抑制率及72h时AI比较
　　见表1。
　　2.3 流式细胞检测
　　对照组细胞G0/G1期分布多，药物组出现典型凋亡峰，S期细胞增多，随药物剂量的增加及时间延长而增加，提示药物联合组细胞受阻于S期。
　　3 讨论
　　在抗肿瘤药物作用和细胞凋亡的研究中，多数抗肿瘤药物作用于肿瘤细胞增殖的不同时期，从而诱导细胞死亡。但是抗肿瘤药物在杀伤肿瘤细胞的同时，会对正常的组织细胞带来损伤[12]。
　　既往的研究提示，EPA能明显抑制肿瘤的发生、生长和转移速度，对防治肺癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌和子宫癌等有积极作用，其抗癌的主要机制：抑制起源于花生四烯酸（AA）的花生酸类的生物合成，影响转录因子的活性、基因表达、信号的转录，增强免疫，脂质过氧化[13-15]，清除自由基，修复损伤的细胞DNA[16]，避免损伤细胞凋亡或突变为肿瘤细胞。顺铂系铂的金属络合物，作用类似于烷化剂，主要作用靶点为细胞DNA，作用于DNA链间及链内交链，形成DDP-DNA复合物，干扰DNA复制或与核蛋白及胞浆蛋白结合，属于细胞周期非特异性药物[17，18]。
　　本研究表明，EPA对肺腺癌A-549细胞具有抑制增殖作用和诱导细胞凋亡作用，在HE染色后光镜和倒置显微镜观察，添加EPA的实验组细胞呈现明显凋亡改变，从形态学上证明了EPA具有诱导细胞凋亡的作用。添加EPA和顺铂的实验组比单纯添加顺铂组抑制A-549细胞的作用更明显，同时实验显示，随着EPA剂量的增加，其抑制细胞增殖及诱导凋亡作用明显增强，细胞被阻止在S期，进一步证实了EPA联合顺铂对A-549细胞的作用呈量效关系，并具有时间依赖性。
　　总之，在体外实验中，EPA对人肺腺癌A-549细胞株有生长抑制作用，并呈现时间与量效关系，联合顺铂对细胞株作用更明显。其抑制肿瘤细胞机制可能为影响A-549细胞株的转录因子活性，联合顺铂改变A-549细胞株增殖过程中的基因表达，转录信号调控，干扰肿瘤细胞的DNA复制等。通过上次[9]和本次实验，我们认为EPA有望成为新型抗肿瘤药物，联合顺铂等传统抗肿瘤药物，在序贯治疗肺腺癌中很有前景。下一步的研究将主要为EPA联合其他抗肿瘤药物作用于肺腺癌A-549细胞株的研究，EPA抗肿瘤作用的最佳剂量以及EPA联合每一种抗肿瘤药物的最佳生物结合率等。
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　　（收稿日期：2011-06-10）
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