清除自由基最好的方法【野生鱼腥草黄酮类化合物清除DPPH自由基的作用】
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摘要:以六盘水本地野生鱼腥草为原料,70%乙醇作为提取介质,提取野生鱼腥草黄酮类化合物。以抗坏血酸( VC)和VE为对照品,采用DPPH法研究野生鱼腥草黄酮提取物对自由基的清除作用。结果表明,野生鱼腥草黄酮提取物具有较强的抗氧化作用,在其浓度为51.644g/mL时其清除率可达62.27%,显著高于相同浓度下的VC和VE的清除率。因此,野生鱼腥草黄酮提取物可作为一种天然抗氧化剂。
关键词:鱼腥草;黄酮;DPPH自由基
中图分类号:Q58
文献标识码:A
文章编号:1674-9944(2010)07-0175-03
1 引言
生物体系中存在着大量的脂质氧化和自由基反应。现代医学研究证明,衰老、癌症及炎症等疾病与体内脂质过氧化和自由基有着直接的关系[1]。自由基会使体内的脂质和蛋白质发生链式反应,造成相关细胞结构与功能的破坏,其氧化产物和中间产物也会导致生物膜、酶、组织、基因等损伤,使人体发生病变。在抗氧化酶与内源抗氧化剂的合成量降低的情况下,如果不及时从体外补充外源性抗氧化剂以提高机体抗氧化能力,人体就会加速衰老、易患疾病。天然抗氧化剂有抑制体内脂质过氧化和氧自由基的作用,同时可促进体内抗氧化酶与内源性抗氧化剂的合成。因此,对清除自由基和抑制脂质过氧化作用的天然抗氧化剂研究,己得到普遍关注[2]。
鱼腥草(�Houttuynia cordata Thunb�)为三白草科多年生草本植物蕺菜的干燥水上部分。产于我国长江流域以南各省。夏季茎叶茂盛花穗多时采收,洗净,阴干用或鲜用,名见《名医别录》。唐苏颂说:“生湿地,山谷阴处亦能蔓生,叶如荞麦而肥,茎紫赤色,江左人好生食,关中谓之 。菹菜,叶有腥气,故俗称:鱼腥草。” [3]
黄酮类化合物(Flavonoids)又称生物类黄酮(Bioflavonoid),一般能溶于水、稀乙醇、乙酸乙酯等极性溶剂中,难溶于乙醚、氯仿和苯。黄酮具有显著的抗氧化性能。黄酮类化合物具有消炎、改善微循环、抑菌、抗肝炎病毒、抗肿瘤等生理功能,有很高的药用价值。其抗氧化作用早已被人们所重视[4,5]。
2 材料与方法
2.1 原料与试剂
野生鱼腥草(采自六盘水牛亡山),二苯代苦味酰自由基(DPPH)为Sigma公司产品,抗坏血酸(VC),VE,芦丁(Rutin)标准品(比利时进口,北京化学试剂有限公司),无水乙醇,Tris,亚硝酸钠,硝酸铝,氢氧化钠,等试剂均为市售国产分析纯。
2.2 仪器
紫外分光光度计(UV-9100,北京瑞利公司),电子天平(SartoriusBS110S,北京赛多利斯仪器系统有限公司),高速万能粉碎机(FW80型,天津泰斯特仪器有限公司)。
2.3 鱼腥草黄酮类化合物样品的制备[6]
2.3.1 鱼腥草黄酮类化合物的提取方法
准确称取新鲜鱼腥草(65℃烘干至恒重)1g,于烧瓶中加入30mL70%的乙醇,65℃水浴浸提1.5h,过滤,并用70%乙醇定容至50mL,得到鱼腥草黄酮提取液。
2.3.2 鱼腥草黄酮类化合物样品浓度测定
绘制标准曲线。称取在120℃干燥至恒重的芦丁标准品10mg,用70%的乙醇溶解并定容至100mL,使其浓度为100μg/mL。将芦丁溶液用70%的乙醇稀释成0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100μg/mL,各取1mL于试管中,加70%的乙醇1mL,加5% NaNO2溶液0.3mL,摇匀,静置6min,然后加10% Al(NO3)3溶液0.3mL,摇匀,静置6min,最后再加4% NaOH溶液2mL,摇匀,静置15~20min后,于510nm波长处测定吸光度�A�。
根据标准曲线的制作方法,以浓度(�C�,μg/mL)为横坐标,吸光度(�A�,510nm)为纵坐标,进行线性回归,得到回归方程:
�y�=0.00262�x�-0.01314,�r�=0.9992
鱼腥草黄酮类化合物样品含量的测定步骤:分别吸取1mL样品于10mL容量瓶中,用70%乙醇稀释到刻度。分别取1mL稀释液于试管中,加70%乙醇1mL,依次加入5% NaNO20.3mL,混匀后静置6min,加10% Al(NO3)3 0.3mL,混匀后静置6min,加4%NaOH溶液2mL,摇匀,静置10min,同时以70% 乙醇代替样品液配制空白试剂。在510nm 波长处测定吸光度。
2.4 鱼腥草黄酮类化合物对DPPH自由基的清除实验[7,8]
DPPH溶液的配制:准确称取44mgDPPH,用无水乙醇溶解并定容于100mL容量瓶中,DPPH浓度为120μmo1/L,避光保存(0~4℃)。对照:0.1mL无水乙醇与3mL120μmo1/LDPPH溶液加入同一试管中,摇匀,在黑暗中放置30min,以无水乙醇为空白在517nm测定其吸光度�Ac�。
将鱼腥草黄酮提取液分别取0.1mL与3mL120μmo1/LDPPH溶液加入同一试管中,摇匀,在黑暗中放置30min,以无水乙醇为空白在517nm测定其吸光度�Ai�,并以下式计算其清除率:清除率(%) =[(�Ac-Ai�)/�Ac�]×100%,式中,�Ac�:0.1mL无水乙醇加3.0mLDPPH溶液的吸光度;Ai:0.1mL待测液加3.0mLDPPH溶液的吸光度。按照上面公式计算清除率,清除率越大抗氧化能力越强。
3 结果与分析
3.1 鱼腥草黄酮类化合物样品浓度测定结果
根据实验所得标准曲线回归方程为�y�=0.00262�x�-0.01314(式中�y�为吸光度,�x�为浓度(μg/mL)),计算样品液浓度,在510nm下测得鱼腥草黄酮提取液的吸光度�y�=0.122,根据公式计算得到�x�=51.644μg/mL。
3.2 对DPPH自由基的清除作用
DPPH在有机溶剂中是一种稳定的自由基,呈紫色,在517nm处有强吸收,在有自由基清除剂存在时,DPPH的孤电子被配对,使其颜色变浅,在最大吸收波长处的吸光度变小,且这种颜色的变浅程度与配对电子数成化学计量关系。因此,可通过在此波长处吸光度的测定来评价自由基的清除情况。
分别取鱼腥草黄酮提取液0.06、0.08 、0.10mL分别加入70%的乙醇0.04、0.02、0mL,作为不同浓度的鱼腥草黄酮类化合物的样品液,分别标示为样品1、样品2和样品3。
测得�Ac�=1.076,根据公式清除率(%) =[(�Ac-Ai�)/�Ac�]×100%计算清除率,其结果如表1。
表1 不同浓度的鱼腥草黄酮提取液对DPPH的清除作用
样品123
样品浓度/μg/mL
30.98641.31551.644
吸光度0.6130.5160.406
清除率/%43.0352.0462.27
�
由表1可知,鱼腥草黄酮提取液对DPPH具有较好的清除作用,且在提取液浓度为51.644μg/mL时,清除效果最好,达到62.27%。
3.3 不同抗氧化剂清除DPPH自由基的比较
由表1可知,鱼腥草黄酮提取液对DPPH的最佳清除浓度51.644μg/mL,将VC、VE分别配制成51.644μg/mL的浓度,然后分别取鱼腥草黄酮提取液、VC、VE3种抗氧化剂0.1mL与3mL120μmol/LDPPH溶液加入同一试管中,摇匀,在黑暗中放置30min,以无水乙醇为空白在517nm测定其吸光度�Ai�,并分别计算其清除率,结果见下表2。
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表2 不同抗氧化剂清除DPPH自由基的比较
抗氧化剂类别浓度/μg/mL吸光度�Ai�清除率/%
野生鱼腥草黄酮提取液51.6440.40662.27
VC51.6441.0700.60
VE51.6441.0591.00
由表2可以看出,在相同浓度下,鱼腥草黄酮提取液的抗氧化能力显著高于VC与VE。
4 结语
野生鱼腥草中含有黄酮类化合物对DPPH自由基有较强的清除能力。而且黄酮类化合物对DPPH自由基的清除效果与黄酮浓度成正比。在相同浓度下,野生鱼腥草黄酮提取液的抗氧化能力显著高于VC与VE的。野生鱼腥草中黄酮类化合物含量高,提取工艺简单,重复性好,能有效清除自由基,是较强抗氧化性的保健食品,有很大的开发前景。
参考文献:
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DPPH Radical Scavenging Effect of the Houttuynia Cordata
Thunb Flavonoids
Zhang Chunsheng, Fang Yumei, Wang Yihong, Tan Ping
�(Liupanshui Teachers Institute; Shuicheng, 553004, China)�
Abstract: With the local materials of �Houttuynia cordata� Thunb at Liupanshui, the activity component was extracted with 70% ethanol. Using the assay system of DPPH, the antioxidant activities of �Houttuynia cordata� Thunb flavonoids were studied and compared with those of VE and VC. The result shows that the extract of the �Houttuynia cordata� Thunb flavonoids could inhibit lipid peroxidation and scavenge active oxygen free radicals. The elimination of the density of the �Houttuynia cordata� Thunb flavonoids (51.644μg/mL) was attained by 62.27%, and remarkable exceeded the same density VEand VC. So the �Houttuynia cordata� Thunb flavonoids showed strongest inhibitory effect on the antionxidation of superoxidized anionic and lipid peroxidantion.
Key words: houttuynia cordata thunb; flavonoids; DPPH free radical
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