龙血竭总黄酮纯化工艺研究

周云龙 彭霜 李江 李争艳 余晓玲 陈凌云

摘要：目的  建立龙血竭总黄酮的纯化工艺。方法  以龙血素A、龙血素B的吸附率和解吸率为评价指标，采用大孔树脂纯化龙血竭总黄酮，确定最佳纯化工艺。结果  大孔树脂纯化龙血竭总黄酮的最佳工艺为：选择D101大孔树脂，用0.3%NaOH溶液溶解龙血竭乙酸乙酯提取物，上样质量浓度为12 mg/mL，上样量为2 BV，上样体积流量为1.0 BV/h，依次用纯化水洗脱杂质至流出液呈中性为止，再用80%乙醇5 BV洗脱。得到的龙血竭总黄酮含量以龙血素A和龙血素B计，比药材中含量提高了3倍。结论  D101大孔树脂可用于龙血竭总黄酮的纯化，该工艺稳定可靠。

关键词：龙血竭;总黄酮;大孔树脂;纯化工艺

中图分类号：R284.2    文献标识码：A    文章编号：1005-5304（2019）08-0083-06

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.08.017      开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract：
Objective To establish a purification process for total flavonoids from Dragons blood. Methods The adsorption rate and desorption rate of Loureirin A and Loureirin B were used to evaluate the purification process. The macroporous adsorption resin was used to purify the total flavonoids of Dragons blood， and the best process was determined. Results The optimal process for the purification of total flavonoids from Dragons blood by macroporous adsorption resin was as follows：
D101 macroporous resin was selected， and the ethyl acetate extract of Dragons blood was dissolved in 0.3% NaOH solution. The concentration of the sample was 12 mg/mL. The loading amount was 2 BV. The loading volume was 1.0 BV/h. The impurities were eluted with purified water until the effluent was neutral， and then eluted with 80% ethanol 5 BV to obtain the total flavonoids of Dragons blood. The contents of Loureirin A and Loureirin B was increased by 3 times compared with the materia medica. Conclusion D101 macroporous resin can be used in the purification process of total flavonoids from Dragons blood. The process is stable and reliable.

Keywords：
Dragons blood; total flavonoids; macroporous resin; purification process

龍血竭是百合科龙血树属植物剑叶龙血树Dracaena cochinchinensis（Lour.）S. C. Chen的树脂，主要含有黄酮类、皂苷类、酚类、有机酸、酯类和挥发油等成分，具有活血散瘀、定痛止血、敛疮生肌功效，用于跌打损伤、瘀血作痛、气血凝滞、外伤出血、脓疮久不收口。现代研究表明，龙血竭具有抗炎、镇痛，活血、止血，抗细菌、真菌，改变血液流变学等药理作用[1-5]。其中黄酮类成分是其主要有效成分，龙血竭中的黄酮类化合物主要有二氢查耳酮、查耳酮、黄烷、二氢黄酮和黄酮等[6-11]。有研究表明，龙血素A、B、C及7-羟基-4"-甲氧基黄烷、4"，7-二羟基高异黄烷具有体外活血化瘀药理活性[12]。陈素等[13]研究表明，龙血竭总黄酮是龙血竭抗炎镇痛的主要有效部位。目前，龙血竭总黄酮含量多采用比色法进行测定，但由于龙血竭本身呈红色，在比色法测定过程中会对显色结果造成一定的影响，导致测定结果不准确，故本研究采用HPLC测定总黄酮中的龙血素A、B，通过这2种成分含量来表征龙血竭总黄酮的含量，并以两者的吸附率和解吸率为指标进行纯化工艺研究。迄今尚未见使用大孔树脂提取纯化龙血竭总黄酮工艺的研究报道。因此，本研究考察大孔吸附树脂对龙血竭总黄酮中龙血素A、龙血素B的静态、动态吸附性能，筛选最优纯化工艺，为后续相关开发和综合利用提供依据。

1  仪器与试药

AgiLent 1100高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司），101-2ABA型电热鼓风干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司），CP124C型电子天平（奥豪斯仪器有限公司），RV10型旋转蒸发仪（德国IKA集团），THZ-82A型恒温振荡器（常州国华电器有限公司），DFY-500型高速中药粉碎机（温岭市林大机械有限公司）。

龙血竭饮片，昆明市中医医院提供;龙血素A对照品（批号110736-200934）、龙血素B对照品（批号111558-201006），中国食品药品检定研究院;大孔树脂AB-8、HPD-100、HPD-100B、HPD-400、HPD-500、D101、NKA-9，聚酰胺，安徽三星树脂科技有限公司;乙腈（色谱纯），Merk股份有限公司;其余试剂均为分析纯。

2  方法与结果

2.1  指标成分含量测定

2.1.1  对照品溶液制备

分别取龙血素A、龙血素B对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，制成分别含龙血素A、B含量分别为86.4、41.2 μg/mL的混合对照品溶液。

2.1.2  龙血竭飲片供试品溶液制备

取龙血竭饮片，用万能粉碎机进行粉碎，过80目筛，即得龙血竭饮片粉末，备用。取龙血竭饮片粉末约0.1 g，精密称定，用甲醇溶解并定容至25 mL，摇匀，用0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.1.3  龙血竭总黄酮供试品溶液制备

取本实验室制备的龙血竭总黄酮粉末约0.1 g，精密称定，用甲醇使溶解并定容至25 mL，摇匀，用0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.1.4  检测波长选择

在200～400 nm波长范围内对龙血素A、B对照品溶液进行扫描，从光谱图可以看出龙血素A、B在波长275 nm处均有最大吸收，故选择275 nm作为龙血素A、B的检测波长。

2.1.5  色谱条件及系统适用性试验

色谱柱：DIKAM C18（4.6 mm×250 mm，5 ?m）;流动相：乙腈-0.5%冰醋酸（26∶74）;流速：1 mL/min;柱温：35 ℃;检测波长：275 nm;进样量：10 ?L。理论塔板数以龙血素A计算不低于6000。取龙血素A、B对照品溶液及龙血竭饮片供试品溶液各10 ?L，注入液相色谱仪进行测定。色谱图见图1。其中龙血素A、B的理论塔板数均大于15 000，分离度>2.0，拖尾因子满足要求。

2.1.6  线性关系考察

取“2.1.1”项下对照品溶液，分别精密吸取1、5、10、15、20、25 μL注入液相色谱仪，按“2.1.5”项下色谱条件测定峰面积，以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。结果龙血素A回归方程为Y=3735.9X-6.052 7（r2=0.999 9），表明在0.086 4～2.16 ?g范围内，龙血素A峰面积与进样量有良好的线性关系;龙血素B回归方程为Y=3131.7X-22.62（r2=0.999 9），表明在0.041 2～1.03 ?g范围内，龙血素B峰面积与进样量的线性关系良好。

2.1.7  稳定性试验

取龙血素A、B对照品及供试品适量，依法制备对照品溶液和供试品溶液，于0、4、8、12、16 h，分别吸取10 μL注入液相色谱仪，测定峰面积。结果对照品溶液和供试品溶液中，16 h内龙血素A、B的峰面积RSD<2%，表明龙血素A、B的甲醇溶液在16 h内稳定。

2.1.8  重复性试验

取同一批次龙血竭饮片粉末6份，各0.1 g，精密称定，按“2.1.2”项下方法制备，按“2.1.5”项下色谱条件测定龙血素A、B的含量。结果显示，龙血竭饮片中龙血素A、B含量RSD=2.43%，表明本方法重复性良好。

2.1.9  加样回收率试验

精密量取同一已知含量供试品溶液（含龙血素A 22.92 μg/mL、龙血素B 23.11 μg/mL）9份，每份5 mL，精密加入对照品溶液（含龙血素A 86.4 μg/mL、龙血素B 41.2 μg/mL）适量（5、10、15 mL，每个水平3份），加甲醇定容至25 mL，按“2.1.5”项下色谱条件测定龙血素A、B的含量，计算加样回收率。结果见表1、表2。龙血素A、B的平均加样回收率分别为99.80%、98.85%，RSD均小于3%，表明本方法稳定可靠。

2.2  大孔树脂筛选

2.2.1  龙血竭总黄酮粗提物制备

按文献[14]方法，用10倍量的乙酸乙酯回流提取2次，每次1 h，合并2次乙酸乙酯液，回收乙酸乙酯，60 ℃减压干燥，备用。

2.2.2  上样液制备

取“2.2.1”项下粗提物，用0.3%NaOH溶液溶解，配制成龙血竭总黄酮粗提物浓度为12 mg/mL的溶液，备用。

2.2.3  大孔树脂预处理

大孔树脂先用95%乙醇浸泡24 h充分溶胀，用95%乙醇冲洗，至醇液加水不产生浑浊为止，再用纯化水洗至无醇味，备用。

2.2.4  静态吸附-解吸试验

称取预处理好的大孔树脂AB-8、HPD-100、HPD-100B、HPD-400、HPD-500、D101、NKA-9、聚酰胺各2 g，置150 mL锥形瓶中，加入“2.2.2”项下上样液20 mL，25 ℃恒温振荡器上振摇24 h，使其充分吸附，取出，过滤，取5 mL滤液，水浴蒸干，用甲醇溶解并定容至5 mL，过滤，取续滤液，测定龙血素A、B的含量。将滤出的树脂放入150 mL锥形瓶中，各加入95%乙醇20 mL，将其置于25 ℃恒温振荡器上振摇24 h，使其充分解吸，取解吸液，过滤，取续滤液，测定龙血素A、B含量。分别计算龙血素A、龙血素B的吸附率、解吸率及回收率。吸附率（%）=（吸附前样液浓度-吸附后样液浓度）÷吸附前样液浓度×100%，解吸率（%）=解吸后样液浓度÷（吸附前样液浓度-吸附后样液浓度）×100%，回收率（%）=吸附率×解吸率×100%，结果取龙血素A和龙血素B的平均值，见表3。

可以看出，大孔树脂HPD-100和D-101对龙血素A、B的回收率较高，两者结果较接近，而大孔树脂D-101的回收率最高，故选择D-101为龙血竭总黄酮的分离树脂。

2.2.5  大孔树脂D-101静态吸附动力学特性

称取预处理好的大孔树脂D-101 2.0 g，置150 mL具塞三角锥形瓶中，加入“2.2.2”项下上样液30 mL，置25 ℃恒温振荡器上振荡，每隔30 min取样1 mL，按“2.2.4”项下方法处理样品，测定龙血素A、B的含量，并计算吸附率，绘制大孔树脂D-101的静态吸附曲线，结果见图2。可见，2.5 h以后大孔树脂对龙血竭总黄酮的吸附基本达到饱和状态。

2.2.6  大孔树脂D-101静态解吸动力学特性

将“2.2.5”项下过滤出的树脂置于150 mL具塞三角锥形瓶中，加入95%乙醇30 mL，置于25 ℃恒温振荡器上振荡，每隔30 min取样1 mL，测定龙血素A、B的含量，并计算解吸率，绘制大孔树脂D-101的静态吸附曲线，结果见图3。可见，静态解吸1 h后龙血竭总黄酮解吸基本完成。

2.3  纯化分离工艺研究

2.3.1  上样液浓度考察

称取5份预处理好的大孔树脂D-101各2.0 g，置150 mL具塞三角锥形瓶中，精密加入龙血竭总黄酮浓度分别为6.156、8.18、10.100、12.044、14.032 mg/mL的供试品溶液各25 mL，置于25 ℃恒温振荡器上振荡2 h，取上清液，测定龙血素A、B的含量，计算吸附率，绘制吸附曲线，结果见图4。可见，在浓度达到14.032 mg/mL时，大孔树脂对龙血素A、B的吸附明显下降，考虑吸附效率，选择12.044 mg/mL为最佳上样液浓度。

2.3.2  上样体积流量考察

将预处理好的大孔树脂D-101濕法装柱（1.0 cm×12 cm），龙血竭总黄酮上样液为1 BV，控制上样体积流量分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 BV/h，测定漏出液中龙血素A、B的含量，计算吸附率。结果大孔树脂对龙血素A的吸附率分别为93.64%、92.89%、87.21%、75.35%、62.31%，对龙血素B的吸附率为94.78%、94.25%、88.89%、74.45%、59.81%，见图5。可见，吸附率随上样体积流量增大而减小，当体积流速为1.5 BV/h时，大孔树脂对龙血素A和龙血素B的吸附均出现大幅下降，可能由于树脂与样品溶液接触时间过短，造成树脂对总黄酮的吸附不完全，故选择上样体积流量为1.0 BV/h。

2.3.3  上样体积考察

将预处理好的大孔树脂D-101湿法装柱（1.0 cm×12 cm），将浓度为12 mg/mL的龙血竭总黄酮粗提液以1.0 BV/h体积流量上样，每5 mL收集1管，测定龙血素A、B的含量，计算泄漏率，并绘制动态吸附曲线。泄漏率（%）=滤出液中龙血素A、B的含量÷上样液中龙血素A、B的含量×100%。结果见图6。可见，初始阶段流出液中无龙血素A和龙血素B泄漏，当上样量增加到1.8 BV时，流出液中开始出现龙血素A和龙血素B，到2 BV时出现明显泄漏，故选择上样体积为2 BV。

2.3.4  乙醇浓度考察

称取6份预处理好的大孔树脂D-101各2.0 g，置于150 mL具塞三角锥形瓶中，加入一定量的龙血竭总黄酮上样液，待吸附平衡后，分别加入40%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇30 mL，置于25 ℃恒温振荡器上振荡解吸2 h，取上清液，测定龙血素A和龙血素B的含量，计算其解吸率。龙血素A和龙血素B的解吸率和乙醇浓度的关系见图7。可见，当乙醇浓度逐渐升高时，龙血素A和龙血素B的解吸率均逐渐升高，而乙醇浓度为80%时解吸率达到最大值，当乙醇浓度为90%时解吸率反而下降，可能由于乙醇浓度升高后洗脱性能增强，被洗脱下来的杂质增多，导致解吸率降低。因此，选择体积分数为80%乙醇进行洗脱较为适宜。

2.3.5  洗脱体积考察

上样吸附后，先用纯化水洗去杂质至流出液呈中性为止，然后用80%乙醇进行洗脱，每10 mL接取1管洗脱液，测定龙血素A和龙血素B的含量，计算洗脱率，并绘制动态洗脱曲线。洗脱率（%）=洗脱液中龙血素A、B的含量÷上样液中龙血素A、B的含量×100%。结果见图8。可见，80%乙醇洗脱曲线比较集中，当乙醇体积为5 BV时基本能将龙血素A和龙血素B洗脱完全，洗脱率达92.35%，故选择80%乙醇5 BV将龙血竭总黄酮洗脱下来。

2.3.6  最佳工艺验证

按照优化得到的最佳工艺对龙血竭总黄酮进行纯化分离：龙血竭乙酸乙酯提取物用0.3%NaOH溶解，上样浓度为12 mg/mL，上样量为2 BV，上样体积流量为1.0 BV/h，依次用纯化水洗脱杂质至流出液呈中性为止，再用80%乙醇5 BV洗脱，洗脱液回收乙醇，浓缩至干，进行3次试验，结果见表4。龙血竭饮片龙血素A和龙血素B的总含量为1.03%，大孔树脂经D-101纯化后的总黄酮中龙血素A和龙血素B的总含量为3.05%，为龙血竭饮片中含量近3倍。

3  讨论

本研究基于龙血竭总黄酮的抗炎镇痛作用，拟对龙血竭总黄酮进行提取纯化，进而制备醇脂质体凝胶，用于压疮的治疗。由于醇脂质体的载药量小，且龙血竭总黄酮水溶性不好，故需对龙血竭总黄酮进行精制纯化。本研究对龙血竭总黄酮的纯化工艺进行了研究，为后续进行龙血竭总黄酮醇脂质体凝胶的相关研究进行原料准备。

目前有文献报道采用碱溶酸沉法提取龙血竭总黄酮[14]，但相关报道较少，所以本研究采用其他纯化方法对龙血竭总黄酮的纯化工艺进行研究。大孔吸附树脂法是目前能够应用于生产的纯化方法之一，所以本研究选择大孔树脂对总黄酮进行纯化。

由于龙血竭中存在色素，在甲醇、乙醇溶液中显红色，用比色法测定总黄酮时显色后溶液的颜色变化不明显，采用比色法进行总黄酮的含量测定存在干扰，测定结果不准确，经查阅文献，也未发现较合适的总黄酮测定方法，所以，本研究通过龙血素A和龙血素B的含量来表征龙血竭总黄酮的量。但由于龙血素A、B只是龙血竭总黄酮中的2个主要成分，以两者的含量表征龙血竭总黄酮的量尚不够准确，还需要对龙血素A、B与总黄酮的含量关系进行研究，才能更好地表征总黄酮的含量。

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（收稿日期：2018-12-17）

（修回日期：2019-01-16;编辑：陈静）