附子汤对类风湿性关节炎大鼠抗炎及关节影响研究

王波　何友武　赵璐　季卫平

[摘要] 目的 探討附子汤对类风湿性关节炎大鼠抗炎及关节的影响。

方法 本研究将32只SD大鼠随机分成4组：对照组、CIA组、地塞米松组、附子汤组。其中3组通过尾根部皮下注射混合乳剂诱导形成类风湿性关节炎（CIA）模型。附子汤组给予7 mL/kg附子汤，地塞米松组给予0.025 mg/kg地塞米松。对照组和CIA组大鼠给予等剂量生理盐水。监测指标：大鼠体重、右后足厚度和关节炎指数、器官指数（心、肝、脾、肺、肾和胸腺）、TNF-α、IL-1β和IL-6的血清浓度，同时检查滑膜组织病理。

结果 与对照组相比，地塞米松组的大鼠肝、肾指数显著上升（P<0.01）及脾、胸腺指数显著下降（P<0.01）。CIA组和附子汤组的肺、心指数与对照组无显著差异;CIA组、地塞米松组和附子汤组大鼠右后足厚度和关节炎指数与对照组有显著性增加（P<0.01），治疗后足爪厚度显著下降（P<0.01）;CIA组大鼠血清TNF-α，IL-1β和IL-6水平显著高于正常大鼠（P<0.05）。经附子汤及地塞米松治疗，CIA大鼠血清中TNF-α， IL-1β和IL-6的水平均显著下降（P<0.01）;HE染色结果显示对照组滑膜、软骨和骨组织无病变。附子汤和地塞米松治疗后滑膜中病理得到明显改善。

结论 附子汤可以抑制炎症因子的释放来缓解类风湿性关节炎，从而保护关节，为类风湿性关节炎提供了一种有效的治疗药物。

[关键词] 类风湿性关节炎;附子汤;中国传统药物;炎症因子

[中图分类号] R285.5;R593.22          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2020）21-0040-05

Study on effect of aconite decoction on anti-inflammation and joints of rats with chronic infectious arthritis

WANG Bo HE Youwu ZHAO Lu JI Weiping

Department of orthopedic， Lishui People"s Hospital in zhejiang Province（NO. 6 Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， NO.1 Affiliated Hospital of Lishui College）， Lishui 323000， China

[Abstract] Objective To explore the effect of aconite decoction on anti-inflammation and joints of rats with chronic infectious arthritis. Methods In this study， 32 SD rats were randomly divided into four groups：
the control group， the CIA group， the dexamethasone group and the aconite decoction group. Three of the groups were induced to form a model of chronic infectious arthritis（CIA） by subcutaneous injection of mixed emulsion at the tail roots. The aconite decoction group was given 7 mL/kg of aconite decoction and the dexamethasone group was given 0.025 mg/kg of dexamethasone. Rats in the control group and the CIA group were given equal doses of normal saline. The rats were monitored for body weights， right hind foot thicknesses， arthritis indexes， organ indexes（heart， liver， spleen， lung， kidney and thymus） and serum concentrations of TNF-α， IL-1β and IL-6. The synovial tissue pathology was also examined. Results Compared with the control group， liver and kidney indexes of the rats in the dexamethasone group were significantly increased（P<0.01）， and spleen and thymus indexes were significantly decreased（P<0.01）. No significant differences in lung， heart indexes between the CIA group and the control group. The right hind foot thicknesses and arthritis indexes in the CIA group， the deyamethasone group and the aconite deloction groups were significantly increased compared with the control group（P<0.01）， and the hind paw thicknesses were significantly decreased after treatment（P<0.01）. The serum levels of TNF-α， IL-1β and IL-6 of the rats in the CIA group were significantly higher than those of the normal rats（P<0.05）. After treatment with aconite decoction and dexamethasone， the serum levels of TNF-α， IL-1β and IL-6 were significantly decreased in CIA rats（P<0.001）. No lesions in synovial membrane， cartilage and bone tissue in the control group were observed in the results of HE staining. After treatment with aconite decoction and dexamethasone， the pathology of synovial membrane was obviously improved. Conclusion Aconite decoction can inhibit the release of inflammatory factors to relieve chronic infectious arthritis， thereby protecting the joints and providing an effective therapeutic drug for chronic infectious arthritis.

[Key words] Chronic infectious arthritis; Aconite decoction; Traditional Chinese medicine; Inflammatory factors

类风湿性关节炎影响全球0.5%～1.0%的人口，并且在年龄、性别、种族和地理群体之间分布差异很大[1，2]。类风湿性关节炎作为一种系统性自身免疫疾病，其特征为慢性进展性滑膜炎和对称性多关节破坏，主要累及小关节，如果不加控制，随着疾病的进展，大关节和邻近的关节组织也会受累[3，4]。类风湿性关节炎的典型病理学表现为滑膜增生、炎性细胞浸润、血管翳形成、关节软骨损伤及骨侵蚀。该疾病的临床表现主要为慢性的疼痛、关节僵硬和肿胀，最终导致关节畸形、功能障碍和残疾[5]，因此被列为高风险致残性疾病，给社会带来了沉重的经济负担[6]。附子汤是《伤寒论》中一种经典方剂，也是温阳法的代表方剂之一，首见于张仲景《伤寒论·辨少阴病脉证并治篇》第304条“少阴病，得之一二日，口中和，其背恶寒者，当灸之，附子汤主之”。方中以附子温肾阳、散寒湿、通经脉、走骨节和经络、壮阳气、止疼痛。人参大补元气，与附子同用，温阳之中以补气，振奋阳气，驱逐内外寒湿，调营养卫，以调畅肌肤营卫。白术燥寒湿、益中气，与附子同用，温补阳气，驱散寒湿，茯苓健脾益气渗湿，使湿邪得以下行，白芍和营血，通血痹，与附子同用，温阳以益阴，并制约附子之燥性[7，8]。诸药合用，温暖肾阳之中以补阳，驱散寒濕以走内外，以达愈疾之目的[9]。目前有关附子汤对类风湿性关节炎疗效的报道有限。本研究旨在评估附子汤对类风湿性关节炎关节的保护作用，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

SPF级雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠购自温州医科大学实验动物中心（实验动物生产许可证号：SYXK（浙）2015-0009），重量为180～220 g。将所有动物饲养在温控室[（22±2）℃]中，并自由食用标准颗粒饲料和水。在实验前将所有大鼠适应性喂食7 d。所有动物实验均按照温州医科大学动物伦理委员会规章制度进行。在适应性喂养后，将32只大鼠随机分成4组，每组8只：对照组（Control Group），CIA组（CIA Group），地塞米松组（Dex Group），附子汤组（FD Group）。

1.2 实验试剂

附子、白术、茯苓、党参和白芍均购自丽水市人民医院中药房。地塞米松针购自卓峰制药有限公司（郑州，中国）。牛Ⅱ（CⅡ）胶原蛋白及不完全弗氏佐剂（IFA）来自Chondrex，Inc（华盛顿，美国）。TNF-α，IL-1β和IL-6的ELISA试剂盒均购自cusabio biotech co，.LTD.（武汉，中国）。

1.3 附子汤的制备

用100 mL水浸泡附子（36 g），白术（36 g）、茯苓（27 g）、党参（18 g）和白芍（27 g）与400 mL水混合浸泡30 min。大火加热附子，直至沸腾，调低至小火煎30 min[22，23]。随后将浸泡的白术、茯苓、党参和白芍加入到正在煎煮的附子中，再共同煎煮30 min。倒出药汁，用双层吸水纱布过滤。再向煎煮的药物中加入等量的水，以相同方式加热30 min进行第二次煎煮。将第一次和第二次煎煮的药汁混合，加热浓缩至18 mL，其中生药量2 g/mL，置于冰箱中4℃保存。

1.4 类风湿性关节炎（CIA）大鼠模型的建立及给药

把溶于醋酸的牛Ⅱ胶原蛋白（2 mg/mL）与不完全弗氏佐剂按1：1量配比，在冰浴下使用恒温磁力搅拌器充分混合，制备成混合乳剂，取少量混合乳剂滴在水面不散开认为混合乳剂已制备完成。对除对照组之外的大鼠诱导建立类风湿关节炎模型。第1天于大鼠右后足皮下注射0.1 mL混合乳剂，第7天加强免疫，于相同部位再次注射相同剂量混合乳剂。第14天CIA模型建立完成[9]。对照组在第1天及第7天于相同位置注射等量生理盐水。第15～28天，附子汤组每天同一时间大鼠灌胃附子汤剂量为7 mL/kg，地塞米松组给药剂量为0.025 mg/kg，对照组和模型组大鼠喂以等剂量生理盐水。

1.5 体重和足爪厚度的测定

CIA模型建立成功后，每3天监测大鼠的生存状态和记录体重。使用游标卡尺测量右后足厚度（MNT Technology Co.，Ltd.，Germany），评估右后爪的肿胀程度并拍取照片。

1.6 评估关节炎指数（AI）

从第3天开始每3天评估一次大鼠关节炎严重程度。通过五级评分量表评估类风湿关节炎的严重程度：4=整个足爪及踝关节肿胀;3=整个足爪肿胀;2=脚趾和脚趾关节肿胀;1=脚趾关节红斑或肿胀;0=无红斑或肿胀。记录每只大鼠右后足的AI评分[10]。

1.7 血清中炎症因子水平的测定

第28天，从尾静脉取血，置于促凝管中30 min，随后以4000 rpm离心10 min使血清分离。将血清储存在-80℃冰箱中。严格按照酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒的说明操作，通过ELISA试剂盒测量血清中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）和白细胞介素-6（IL-6）的浓度，检测波长为450 nm。

1.8 组织病理学检查

处死大鼠后，取右下肢，剥去膝关节表层肌肉和皮肤组织，并在10%缓冲福尔马林（pH=7.0）中固定3 d。在室温下于10%硝酸中脱钙3 d后流水冲洗1 d，再包埋在石蜡中切成薄片（4 μm），切片用苏木精和曙红（HE）染色。DM-2000光学显微镜和3100KPA显微成像系统观察组织病理学变化。

1.9 器官指数

处死大鼠后取出器官（包括心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和胸腺），用生理盐水冲洗后擦干，记录器官的湿重以计算器官指数。器官指数为器官重量与大鼠体重的比值（mg/g）。

1.10 统计学方法

采用GraphPad Prism 8.0和SPSS24.0统计学软件进行分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组比较采用t检验，多组比较采用单因素方差分析One-Way ANOVA;计数资料采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 附子汤对大鼠足肿胀和关节炎指数的影响

在二次免疫后4 d，造模后的大鼠开始出来明显炎症表现，红斑、大鼠后足中部、踝關节出现轻微程度的肿胀。大鼠尾巴部位明显有水肿表现。各组大鼠右后足厚度均有增加，其中对照组增加最不明显，模型组右后足厚度一直维持在较高水平。其他两组右后足厚度在第14天达到峰值，此时，对各组大鼠给予药物干预。随着药物治疗，肿胀逐渐消退，足爪厚度显著下降，其中地塞米松组下降最明显（P<0.01），其次为附子汤组（P<0.01）。见表1。模型组关节炎指数一直维持在较高水平，其他两组关节炎指数在第14天达到峰值，随着药物治疗，肿胀逐渐消退，关节炎指数显著下降，其中地塞米松组下降最明显（P<0.01），其次为附子汤组（P<0.01）。见表2。

2.2 附子汤对CIA大鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6浓度的影响

模型组大鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平显著高于正常大鼠（P<0.01），说明造模很成功。经附子汤及地塞米松治疗，CIA大鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的水平均显著下降，地塞米松组下降最为明显（P<0.01），其次为附子汤组（P<0.01）。见表3。

2.3 附子汤对CIA大鼠组织病理学的影响

病理切片通过光学显微镜在40倍物镜下进行观察，模型组大鼠经过注射乳剂（牛Ⅱ型胶原和不完全弗氏佐剂等体积混合乳化），引发大鼠体内产生免疫反应。为了评价附子汤对类风湿大鼠的作用，进行病理检查，结果如封三图3所示。对照组滑膜，软骨和骨组织无明显病变。模型组病理切片显示滑膜中炎性细胞浸润，组织水肿和增生伴软骨破坏。口服附子汤和地塞米松后，大鼠膝关节病理得到明显改善。附子汤组病理切片具有较少的滑膜增生，炎细胞浸润和关节软骨侵蚀。地塞米松组的病理切片较附子汤组有更少的炎性细胞浸润、组织水肿、滑膜增生、软骨破坏（封三图4）。与其他三组相比，地塞米松组存在软骨溶解。从病理角度证明附子汤抗炎作用显著，可以减缓类风湿性关节炎的发病病程，有效的控制炎症症状。

2.4 对大鼠体重变化和器官指数的影响

每3天对所有大鼠体重进行监测，以研究药物对其体重变化的影响。在整个实验中，各组大鼠的体重均逐渐增加。对照组大鼠体重增加最明显。附子汤组大鼠的体重增幅较模型组要大，地塞米松组大鼠体重增幅较模型组明显减少且实验后期体重增幅趋于平缓。

计算心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和胸腺指数，以研究药物对大鼠器官功能的影响。与对照组相比，地塞米松组的大鼠肝、肾指数显著上升（P<0.01）及脾、胸腺指数显著下降（P<0.01）。模型组，附子汤组的器官指数与对照组无显著差异。见表4。

3 讨论

类风湿性关节炎折磨着全世界大约1%的人口，其症状包括由于骨骼和软骨的炎症损伤而导致关节肿胀和变形[11]，严重病例可能导致全身衰竭，包括心血管、肺、心理和骨骼疾病。目前的药物治疗依赖于糖皮质激素和非甾体抗炎药。合成抗风湿药物，如甲氨蝶呤，显示出很强的副作用，如致畸和肝毒性[12，13]。通过抑制炎症功能发挥作用的生物制剂，如抗肿瘤坏死因子-α，可能会因免疫系统减弱而导致高感染风险，如结核病。类风湿关节炎是一种慢性自身免疫性疾病，临床表现为多关节的慢性疼痛、畸形和功能性残疾[14]。CIA大鼠模型是一种简单可靠且可重复的类风湿性关节炎动物模型[15]。由于与人类类风湿关节炎的病理学相似，因此通常用于抗类风湿性关节炎药物的临床前评估[16]。因此建立CIA大鼠模型作为类风湿关节炎的病理模型，以评估附子汤的抗风湿作用。在CIA大鼠建模完成后，对大鼠的足爪肿胀度和关节炎指数进行评估以反映关节炎严重程度以及药物的抗关节炎活性。地塞米松组大鼠的足爪肿胀度和关节炎指数显著减少，说明自身免疫是造成类风湿性关节炎的病因之一。同时，附子汤组的足爪肿胀度和关节炎指数也显著减少，表明附子汤对CIA大鼠的炎症进展具有显著的抑制作用。

随着类风湿关节炎的进展，滑膜细胞显著增生，各种炎症细胞如活化的B细胞、T细胞、浆细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、肥大细胞和中性粒细胞浸润到滑膜中[17]。随后，肥厚的滑膜层侵入邻近的软骨导致骨侵蚀和不可逆的关节损伤[18]。细胞和细胞因子的复杂调节网络直接涉及类风湿关节炎的多种免疫过程[19]。其中炎性细胞因子和抗炎细胞因子之间的不平衡是促进类风湿关节炎的起始和进展的主要因素。随着人们对类风湿关节炎认识的加深，活性巨噬细胞产生的TNF-α、IL-1β和IL-6被认为是类风湿关节炎中重要的炎性细胞因子，参与炎症的形成和关节破坏[20]。本研究结果显示模型组大鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6浓度较对照组显著升高，表明模型制备成功。附子汤组大鼠的TNF-α、IL-1β和IL-6浓度与CIA模型相比显著降低，这与预期结果相同，证明附子汤可以抑制CIA大鼠关节炎的进展，这与之前的结论一致。本研究也通过病理学评估药物对类风湿关节炎的关节保护作用，结果进一步证实了附子汤对关节内滑膜炎的抑制作用。模型组病理切片显示明显的滑膜增生、组织水肿伴严重的炎症细胞浸润。附子汤组大鼠的病理切片显示滑膜增生及组织水肿程度减轻，炎症控制较好，说明附子汤可显著改善CIA大鼠的病理学表现。

地塞米松作为糖皮质激素类药物对炎症性疾病具有显著的疗效而被广泛应用于类风湿关节炎的治疗[21-24]。因此选取地塞米松作为阳性对照药物。本实验结果表明，地塞米松对CIA大鼠的抗炎作用比附子汤更显著和有效。但地塞米松组大鼠表现出体重增长缓慢、器官指数和肝肾功能异常等严重的副作用。附子汤组大鼠表现出关节肿胀的明显缓解和炎性细胞因子显著的减少，但未观察到体重和器官异常的迹象。这些结果表明，附子汤在类风湿关节炎的治疗中具有较低毒性和较好疗效。

[参考文献]

[1] Chehade L，Jaafar ZA，El Masri D，et al. Lifestyle modification in rheumatoid arthritis：
Dietary and physical activity recommendations based on evidence[J]. Current Rheumatology Reviews，2019，15（3）：209-214.

[2] Zhao N，Zheng G，Li J，et al. Text mining of rheumatoid arthritis and diabetes mellitus to understand the mechanisms of Chinese medicine in different diseases with same treatment[J]. Chinese Journal of Integrative Medicine，2018，24（10）：777-784.

[3] Xia ZB，Yuan YJ，Zhang QH，et al. Salvianolic acid B suppresses inflammatory mediator levels by downregulating NF-kappaB in a rat model of rheumatoid arthritis[J].Medical Science Monitor：International Medical Journal of Experimental and Clinical Research，2018，24：2524-2532.

[4] Schinnerling K，Soto L，García-González P，et al. Skewing dendritic cell differentiation towards a tolerogenic state for recovery of tolerance in rheumatoid arthritis[J]. Autoimmun Rev，2015，14（6）：517-527.

[5] Ward L，Stebbings S，Athens J，et al. Yoga for the management of pain and sleep in rheumatoid arthritis：A pilot randomized controlled trial[J]. Musculoskeletal Care，2018， 16（1）：39-47.

[6] Tsai SW，Hsieh MC，Li S，et al. Therapeutic potential of sclareol in experimental models of rheumatoid arthritis[J].Int J Mol Sci，2018，19（5）：1351.

[7] Xiao Y，Liang L，Huang M，et al. Bromodomain and extra-terminal domain bromodomain inhibition prevents synovial inflammation via blocking IκB kinase-dependent NF-κB activation in rheumatoid fibroblast-like synoviocytes[J]. Rheumatology，2015，55（1）：173.

[8] Jahanbakhshi M，Babaloo Z，Mortazavi-Jahromi SS，et al. Modification of sexual hormones in rheumatoid arthritis patients by M2000 p（beta-D-mannuronic Acid） as a novel NSAID with immunosuppressive property[J]. Endocrine，Metabolic & Immune Disorders Drug Targets，2018，18（5）：530-536.

[9] De Socio A，Perrotta FM，Grasso GM，et al. Incidence of rheumatoid arthritis，psoriatic arthritis and polymyalgia rheumatica in an inland area of central Italy：Results of the CAMPO-RHE study[J]. Postgraduate Medicine，2018， 130（1）：137-141.

[10] 張均田. 现代药理学实验方法[M]. 北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1998：62.

[11] Smolen JS，Aletaha D & McInnes，IB. Rheumatoid arthritis[J]. Lancet，2018，388（10055）：2023-2038.

[12] 王晨，黄鑫，江振洲，等. 类固醇激素在类风湿性关节炎中的作用研究进展[J]. 中国药科大学学报，2015，46（6）：757-763.

[13] 苏杉，王蓉，刘飞，等. 秦艽不同配伍对风寒湿痹类风湿关节炎模型大鼠关节保护作用及其机制[J]. 中国临床药理学杂志，2018，34（21）：2542-2545.

[14] Ellinghaus E，Stuart PE，Ellinghaus D，et al. Genome-wide meta-analysis of psoriatic arthritis identifies susceptibility locus at REL[J]. J Invest Dermatol，2012，132（4）：1133-1140.

[15] Skacelova M，Pavel H，Zuzana H，et al. Relationship between rheumatoid arthritis disease activity assessed with the US7 score and quality of life measured with questionnaires（HAQ，EQ-5D，WPAI）[J]. Current Rheumatology Reviews，2017，13（3）：224-230.

[16] Shim JW，Park MJ. Arthroscopic synovectomy of wrist in rheumatoid arthritis[J]. Hand Clinics，2017，33（4）：779-785.

[17] Senra H，Rogers H，Leibach G，et al. Health-related quality of life and depression in a sample of Latin American adults with rheumatoid arthritis[J]. International Journal of Rheumatic Diseases，2017，20（11）：1684-1693.

[18] Okano T，Inui K，Sugioka Y，et al. High titer of anti-citrullinated peptide antibody is a risk factor for severe carotid atherosclerotic plaque in patients with rheumatoid arthritis：The TOMORROW study[J]. International Journal of Rheumatic Diseases，2017，20（8）：949-959.

[19] Kim SY，Schneeweiss S，Liu J，et al. Effects of disease-modifying antirheumatic drugs on nonvertebral fracture risk in rheumatoid arthritis：A population-based cohort study[J]. J Bone Miner Res，2012，27（4）：789-796.

[20] Li G，Zhao J，Li B，et al. Associations between CCL21 gene polymorphisms and susceptibility to rheumatoid arthritis：A meta-analysis[J]. Rheumatology International，2017，37（10）：1673-1681.

[21] Kim D，Cho SK，Choi CB，et al. Impact of interstitial lung disease on mortality of patients with rheumatoid arthritis[J].Rheumatology International，2017，37（10）：1735-1745.

[22] Jew NB，Hollins AM，Mauck BM，et al. Reliability testing of the Larsen and Sharp classifications for rheumatoid arthritis of the elbow[J]. J Shoulder Elbow Surg，2017，26（1）：140-143.

[23] Singh JA，Saag KG，Bridges SL，et al. 2015 American college of rheumatology guideline for the treatment of rheumatoid arthritis[J]. Arthritis Care & Research，2016， 68（1）：1-25.

[24] Joo YB，Park Y，Kim K，et al. Association of CD8（+） T-cells with bone erosion in patients with rheumatoid arthritis[J]. International Journal of Rheumatic Diseases，2018，21（2）：440-446.

（收稿日期：2019-09-03）

[基金項目] 浙江省公益技术研究项目（LGF18H060004，LGD20H060001）;浙江省医药卫生科技计划项目（2018ZH061）;浙江省丽水市高层次人才培养资助项目（2017RC21）;浙江省丽水市科技计划项目（2017ZDXK04）;温州医科大学教学改革项目（YB JG201840、YBJG2019063）

通讯作者