当归芍药散对肝硬化腹水大鼠的干预作用研究

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[摘要] 目的：研究当归芍药散对肝硬化腹水大鼠的干预作用，并从精氨酸加压素（AVP）途径探讨其对肝硬化腹水的影响。方法：雄性SD大鼠随机分为正常组、模型组、当归芍药散低、中、高剂量组（0.43，0.86，1.72 g·mL^-1）。采用苯巴比妥联合CCl₄法建立肝硬化腹水大鼠模型。收集24 h尿液，观察各组尿排泄情况；滤纸吸收法测定腹腔积液量；全自动生化仪检测血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）；全自动血液凝固分析仪检测血浆凝血酶原时间（PT）；酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测血浆AVP浓度。肝脏组织HE染色，观察组织形态变化。结果：当归芍药散给药组与模型组比较肝功能明显改善：血清ALT，AST水平显著降低，血浆PT明显缩短；肝脏病理组织形态均有不同程度改善；腹腔积液量均明显减少；24 h尿量显著增多；血浆AVP浓度显著降低。结论：当归芍药散可明显改善肝硬化腹水大鼠肝功能，减少腹水生成及延缓肝脏病理改变进程，其作用机制可能与精氨酸加压素有关。

[关键词] 当归芍药散；肝硬化腹水；精氨酸加压素

肝硬化腹水属中医“臌胀”范畴，由肝、脾、肾三脏功能失调，气滞、血瘀、湿浊内蕴所致。祖国医学在该病的治疗上发挥整体观与辨证论治的特色，积累了丰富的临床经验并取得显著疗效[1-4]。当归芍药散出自张仲景所著《金匮要略·妇人篇》，主治“妇人怀妊，腹中疞痛”、“妇人腹中诸疾痛”，为活血利水之代表方，方中当归、芍药、川芎疏肝理气，活血化瘀；茯苓、白术、泽泻利水渗湿，6味药共奏活血利水，调肝理脾之功。临床研究表明[5-6]，当归芍药散治疗肝硬化腹水有较好疗效。但关于当归芍药散对肝硬化腹水的实验研究却鲜有报道，本课题通过研究当归芍药散对肝硬化腹水大鼠模型的作用，并对其作用机制进行探讨，以期为临床治疗提供实验依据。

1材料

1.1药物及试剂 当归、芍药、川芎、白术、茯苓、泽泻，购自安徽协和成药业饮片有限公司，并经安徽中医学院药学院金传山教授鉴定，均符合《中国药典》2010年版项下标准。按原方比例（当归3 g，芍药16 g，川芎8 g，白术4 g，茯苓4 g，泽泻8 g）称量药材，加10倍量50%乙醇，浸泡60 min，水浴回流1.5 h，冷却后收集滤液；再加8倍量50%乙醇水浴回流1.5 h，冷却后收集滤液。合并2次滤液，过滤，水浴浓缩至所需浓度药液。分别制备生药浓度为0.43，0.86，1.72 g·mL^-1的当归芍药散低、中、高剂量药液。CCl₄（分析纯，江苏强盛化工有限公司，批号2008121）；福临门一级菜籽油（中粮东海粮油工业有限公司，批号20111010）；甲醛（分析纯，上海中试化工总公司，批号20100130）；苯巴比妥片（上海信宜药厂有限公司，国药准字H31022038）；无水乙醚（分析纯，上海中试化工总公司，批号20101010）；AVP酶联免疫法试剂盒（上海源叶生物科技有限公司，批号10583R）。

1.2仪器 MP6001电子天平（上海恒平科学仪器有限公司）；TGL^-16B高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；岛津全自动生化分析仪（Olympus）；光学显微镜（日本）；移液器（Eppendorf）；MultiskanMK2酶标仪（Labsystem）；CA-7000全自动血液凝固分析仪（希森美康医用电子上海有限公司）；HH.B11.260-TBS台式电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂）；TB-718生物组织自动包埋机（湖北孝感市泰维电子有限公司）；LEICA RM2135 封闭式切片机（湖北孝感市泰维电子有限公司）；TK-218Ⅱ恒温摊片、烤片机（湖北孝感市泰维电子有限公司）；DP70数码照相装置（Olympus）。

1.3动物 SD大鼠，雄性，SPF级，体重（220±20） g，由江苏南京青龙山动物繁殖场提供，合格证号SCXK（苏）2009-0001。

2方法

2.1分组、造模及给药 雄性SD大鼠随机分为正常组、模型组、当归芍药散低、中、高剂量组，每组10只。适应性饲养1周后，除正常组，其余动物给予35%苯巴比妥溶液作为饮用水，1周后恢复正常饮水，并给予以下浓度CCl₄腹腔注射造模：第2～3周为12%CCl₄油溶液，第4～5周为14%CCl₄油溶液，第6～14周为16%CCl₄溶液，每周2次，给药体积为1 mL·kg^-1，正常组给予等体积的生理盐水。治疗组自造模同时分别灌胃给予当归芍药散低、中、高剂量（相当于生药4.3，8.6，17.2 g·kg^-1）的药液，给药体积按10 mL·kg^-1，每天1次，正常组给予等体积蒸馏水，连续13周。末次给药后12 h后，所有大鼠禁食不禁水，于次日麻醉，取材。

2.2尿量检查 实验第13周，将大鼠置代谢笼内适应性饲养2 d后，收集24 h尿液，考察各组大鼠24 h尿排泄情况。

2.3腹腔积液量测定 参考文献方法[7]，大鼠经乙醚麻醉后，沿腹中线剪开3.0 cm，将规格为2.5 cm × 5.0 cm已称重滤纸迅速塞入腹腔，3 min后滤纸充分吸收腹腔积液，取出，称滤纸重，以2次称量之差计为腹腔积液质量。

2.4肝脏病理检查 取同叶肝脏，剪取一块大小为2.0 cm × 2.0 cm × 0.5 cm的组织，10%福尔马林溶液固定。制作病理石蜡切片，进行苏木素-伊红（HE）染色，光学显微镜下观察并摄相。

2.5肝功能检测 乙醚麻醉后，腹主动脉取血，分别加入非抗凝管、枸橼酸钠抗凝管，室温放置30 min，3 500 r·min^-1离心10 min，分离血清、血浆。全自动生化仪检测血清ALT，AST水平，全自动血液凝固分析仪测定血浆PT。

2.6血浆AVP检测 乙醚麻醉后，腹主动脉取血，肝素钠抗凝，室温放置30 min，3 500 r·min^-1离心10 min，分离血浆。ELISA法检测血浆AVP浓度，具体操作严格按照试剂盒说明进行。

2.7统计学分析 数据采用统计学软件SPSS 11.0进行分析，结果以±s表示，组间比较采用ANOVA分析。方差齐性，使用LSD法进行比较，P<0.05为差异具有显著性。

3结果

3.1当归芍药散对肝硬化腹水大鼠肝脏病理形态学的影响 肝脏HE染色结果显示：正常组肝小叶完整、结构清晰，肝细胞围绕中央静脉呈放射状整齐排列，未见变性或坏死细胞。模型组肝小叶结构破坏，被纤维增生组织间隔形成假小叶，脂肪变性严重，汇管区可见大量炎性细胞浸润。给药组较模型组脂肪变性程度减轻，纤维间隔减少（图1）。

3.2当归芍药散对肝硬化腹水大鼠腹腔积液的影响 模型组大鼠腹腔积液量较正常组显著升高（P<0.01），给药组大鼠腹腔积液量均有不同程度降低，其中当归芍药散高剂量组腹腔积液量显著减少（P<0.05）（表1）。

3.3当归芍药散对肝硬化腹水大鼠肝功能的影响 模型组大鼠血清ALT，AST水平较正常组明显升高（P<0.01）。给药组血清ALT，AST水平均显著降低，其中当归芍药散各剂量组与模型组相比，差异有显著性（P<0.01）。模型组大鼠肝脏合成凝血酶原等凝血因子功能下降，凝血酶原时间PT明显延长（P<0.05）。给药组凝血酶原时间均有不同程度缩短（表2）。

3.4当归芍药散对肝硬化腹水大鼠尿量的影响

24 h尿量表明，模型组尿量较正常组明显减少（P<0.05），当归芍药散各剂量组大鼠尿排泄量随剂量升高而增加，且尿量均大于正常组（P<0.05）（表1）。

3.5当归芍药散对肝硬化腹水大鼠血浆AVP的影响 肝硬化腹水模型组大鼠血浆AVP水平显著升高（P<0.05）。当归芍药散低、中、高剂量组血浆AVP浓度均显著降低（P<0.01）。结合尿量数据，可见血浆AVP水平与尿量呈负相关（表1）。

4讨论

本实验采用苯巴比妥联合CCl₄法复制肝硬化腹水模型。苯巴比妥为肝药酶诱导剂，能促进肝细胞色素P450的合成，加速CCl₄的在体内代谢从而加重肝毒性，缩短了单纯使用CCl₄诱导肝硬化腹水的时间。实验中CCl₄油溶液浓度呈梯度递增，一方面降低了造模过程的死亡率，同时可对肝脏造成渐进性的刺激，逐步加重肝损伤。实验结果表明，模型组肝脏病理检查见假小叶形成，提示肝脏病变进入肝硬化阶段；尿量明显减少，腹腔积液量显著增加，表明腹水形成。综上所述，采用苯巴比妥联合CCl₄法可建立稳定、可靠的肝硬化腹水模型。

肝硬化腹水为“血不利则为水”之典型疾病，水停为标，血虚为本。当归芍药散以活血利水为要义，辅以行气，切合肝硬化腹“水滞、血瘀、水停互结于腹中”的病机。现代研究表明[8]，当归芍药散方中诸药均有保肝或利尿的药理作用：当归有保护肝细胞和促进肝功能恢复的作用；白芍具显著抗肝损伤作用；川芎具有改善门静脉循环障碍，促进肝脏纤维组织溶解的作用；白术有保肝作用，且利尿作用显著；泽泻有保肝、抗脂肪肝及利尿作用；茯苓具有增强免疫、保肝的作用。因此，当归芍药散抗肝硬化腹水具有较好的实验基础。实验结果表明，当归芍药散低、中、高剂量组血清肝功能指标ALT，AST水平显著降低，凝血酶原时间明显缩短，表明当归芍药散可改善肝硬化腹水模型的肝功能水平，以达保肝护肝之效。肝脏病理HE染色表明，各剂量当归芍药散可明显延缓肝硬化病理进程。当归芍药散给药组24 h尿量均显著增多，腹腔积液量明显减少，说明该方具有显著利尿作用，从而达消除腹水的目的。

精氨酸加压素（AVP）又叫抗利尿激素，是由位于视丘下部核团的神经元细胞体合成的一种神经肽类激素，通过轴突运送到垂体后叶并由此入血。肝硬化时由于外周血管扩张，非渗透性刺激使AVP分泌增多，另外，肝脏对AVP的清除率降低，使肾脏集合管对水的通透性明显增加，大量水分被重吸收，最终导致水钠潴留，尿量减少，形成腹水[9]。近年来，AVP受体拮抗剂已应用于临床治疗肝硬化低钠血症、肝硬化腹水等[10-12]，通过抑制水的重吸收，增加不含电解质的自由水排出，有效纠正高容量性和等容量性低钠血症。本研究显示，肝硬化腹水模型组大鼠血浆AVP浓度显著增高，与文献研究相一致。当归芍药散给药组血浆AVP水平明显降低，给药组24 h尿量显著增多。课题组前期在开展当归芍药散对痛经[13]、慢性应激抑郁模型[14]的实验研究中，发现该方对AVP系统有明显的影响，当归芍药散对肝硬化腹水的干预也可能是通过降低血浆AVP浓度，进而促进对水的排泄来实现。

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Study on intervention effect of Danggui Shaoyao San on

rats with cirrhotic ascites

WANG Cheng-ye， XU Fan*， WANG Man-yuan， XUAN Zi-hua， HU Si-yao， ZHOU Yu， LU Jia

（Provincial Key Laboratory of Modern Chinese Medicine， College of Pharmacy， Anhui University of

Traditional Chinese Medicine， Hefei 230031， China）

[Abstract] Objective： To investigate the intervention effect of Danggui Shaoyao San on rats with cirrhotic ascites， and discuss the effect of arginine vasopressin （AVP） on cirrhotic ascites. Method： Male SD rats were randomly divided into the control group， the model group， Danggui Shaoyao San low， middle and high dose groups. The cirrhotic ascites rat model was established by CCl₄ combined with phenobarbital. Their urines were collected at 24 h to observe urine excretion of each group. Filter papers were used to determine the amount of ascites. The levels of serum alanine aminotransferasa （ALT）， aspartate aminotransferase （AST） were detected by the automatic biochemistry analyzer. Plasma prothrombin time （PT） was evaluated by the blood coagulation analyzer. The concentration of AVP in plasma was detected by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. Pathological changes in livers were observed by HE staining. Result： Compared with the model group， the Danggui Shaoyao San group showed significant improvement in live indexes， with notable decrease in serum ALT and AST and the time of PT， improvement in liver pathological changes. Simultaneously， theamount of ascites decreased to varying degrees， with notable increase in urine in 24 h and decrease in AVP concentration in plasma. Conclusion： Danggui Shaoyao San can notably improve liver functions of rats with cirrhotic ascites， reduce the generation of ascites and delay the progress of liver pathological changes. Its mechanism may be related to AVP.

[Key words] Danggui Shaoyao San； cirrhosis ascites； arginine vasopressin

doi：10.4268/cjcmm20130620

[责任编辑 张宁宁]