法国蓝薰衣草挥发油改善记忆障碍的药效评价研究

朱丽云+高永生+宋林珍+李素芳+钱俊青

[摘要] 为研究薰衣草挥发油改善记忆障碍的潜在应用价值，采用GC-MS技术分析了薰衣草挥发油的化学组成，并建立小鼠阿尔茨海默病（Alzheimer′s disease， AD）模型，以跳台实验和脑组织中T-SOD， GSH-PX， CAT等抗氧化酶活性及其产物MDA含量的变化等研究了薰衣草挥发油的改善记忆障碍功能。实验结果表明，GC-MS技术分析鉴定了薰衣草挥发油55种化学成分，主要为萜烯、萜醇和酯类化合物，樟醇和乙酸芳樟酯含量最高，占总挥发油的49.71%。薰衣草挥发油给药组均显著改善了小鼠跳台记忆能力，对小鼠脑组织中GSH-PX、CAT和T-SOD水平均显著高于模型组（P<0.05），MDA在模型组中达到最高，药物组MDA则与正常组水平无差异，体现了薰衣草挥发油显著的抗脑组织氧化活性，存在诱导神经元氧化应激减少的可能性，使记忆获得性障碍出现扭转的作用。

[关键词] 薰衣草挥发油；

记忆障碍；

成分分析；

抗氧化酶

[Abstract] In order to study the potential application value of lavender volatile oil （LVO）， the chemical composition of the volatile oil of lavender was analyzed by GC-MS， and the mouse model of Alzheimer"s disease （AD） was established. Additionally， the antioxidant enzymes activity of T-SOD， GSH-PX， CAT and MDA content were studied. Experimental results showed that 55 kinds of chemical constituents including terpene， terpene alcohol and ester compounds from LVO were identified， and the content of linalool and linalyl acetate was the highest， accounting for 49.71% of the total volatile oil. The ability of mouse platform memory was improved significantly. The levels of GSH-PX， CAT and T-SOD of mouse brain tissue in the treatment group were significantly higher than those in the model group （P<0.05）. The level of MDA reached the maximum value in the model group， while there was no notable difference between the levels of MDA in the drug group and the normal group. The result indicated the significant oxidative activity of LVO， the possibility of induced oxidative stress reduction in neurons， and the reversal effect of memory acquired disorder.

[Key word] lavender volatile oil；

memory impairment；

chemical composition；

antioxidant enzymes activity

挥发油，一类来源于植物花、茎、叶或根等部位，经水蒸气蒸馏、压榨法或CO2超临界萃取等方法提取的具有一定香味的挥发性油状物质，其组成成分复杂多样，主要含各种萜类、芳香族、脂肪族和含氮含硫化合物等。植物挥发油，广泛分布于中药材中，如在心脑血管改善中应用的川穹、麝香、牛黃、花椒和石菖蒲等挥发油，在呼吸系统中止咳、平喘、祛痰消炎等作用发挥的陈皮、姜黄、枇杷、艾叶、麻黄等挥发油，以及改善胃肠道系统的枳实、高良姜等挥发油，在医学领域已得到普遍关注[1]。国内外对挥发油在抗抑郁、缓解焦虑、抗氧化、抑菌消炎以及抗肿瘤等方面的生物活性研究十分活跃[2-3]。

薰衣草，芳香疗法中的明星香草，Itai T和Buchbauer G等报道薰衣草挥发油有利于强化神经系统对抗神经疲劳和抑郁[4-5]，在痴呆病症的芳香疗法上具有理想的效果[6]，Costa等也报道了薰衣草提取物在改善中枢神经系统疾病中的应用[7]，本文在分析鉴定薰衣草挥发油组成成分基础上，建立AD小鼠模型，研究薰衣草挥发油对其行为学、体内抗氧化活性等的影响，试图从氧化应激角度解析薰衣草挥发油对AD小鼠的记忆改善功能及作用机制，为薰衣草挥发油的应用提供基础。

1 材料

薰衣草花（Lavandual angustifolia flower），2016年7月初购自新疆伊犁的夏季法国蓝薰衣草花，由中国计量大学植物学教研室李素芳教授鉴定，标本号为LV20160703，存放于本校海洋食品加工质量控制技术与仪器国家地方联合工程实验室。

实验动物：ICR小鼠，60只，雄性，体质量（20.0±1.1） g，由杭州师范学院动物中心提供。实验动物生产许可证SCXK（沪）2012-0002，饲养房温度（23±1） ℃，相对湿度（55±2）%。遵循的程序符合国家及提供实验动物单位的实验动物福利规则和制度。endprint

试剂盒：总超氧化物歧化酶（T-SOD），谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和过氧化氢酶（CAT）与丙二醛（MDA）等检测试剂盒，南京建成生物工程研究所。

仪器：气相色谱-质谱联用仪Agilent 6890/5973（美国安捷伦）、油浴锅（浙江纳德科学仪器有限公司）、挥发油提取仪（天宫玻璃仪器厂）、ZH-800小鼠跳台记录系统（淮安珂淮仪器有限公司）、超纯水系统（ELGA 公司）、紫外分光光度计（日立HITACHI）、电热恒温水槽（上海一恒科技有限公司）等

2 试验方法

2.1 薰衣草挥发油的提取与化学成分分析

2.1.1 水蒸气蒸馏法提取薰衣草挥发油 取新鲜薰衣草花200 g装于蒸馏隔板上，蒸馏瓶中加10倍的水，加热回流2 h，利用挥发油提取器收集薰衣草挥发油，以无水亚硫酸钠脱水干燥，保存备用。

2.1.2 GC-MS分析薰衣草挥发油成分 将薰衣草挥发油用无水乙醇（色谱纯）稀释100倍，过膜进样。

GC条件：HP-5色谱柱（0.25 μm×0.25 mm×30 m）；
氦气为载气，流速1 mL·min-1；
柱温50 ℃保持1 min，以8 ℃·min-1升温至250 ℃，保持2 min；
气化室温度为220 ℃；
进样量1 μL，分流比为40∶1。

MS条件：离子源为EI源，离子源温度为230 ℃，四极杆温度为150 ℃；
溶剂延迟2 min，质量范围为m/z 50～500。采用美国NIST′08数据库和挥发性成分的GC-MS定性谱库对其进行定性定量分析，挥发油中各成分GC含量的确定为面积归一化法。

2.2 薰衣草挥发油改善记忆障碍实验

2.2.1 动物模型制备与跳台试验 将60只ICR小鼠适应性饲养3 d，饲养环境为（23±1） ℃温度和12 h循环光控实验室，允许随意饮用水。随机分成6组（每组10只），即阴性对照组（control）、东莨菪碱组（scopolamine，简写Sco）、薰衣草挥发油低、中、高剂量组（LVO1+Sco，LVO2+Sco，LVO3+Sco）和石杉碱甲片组（huperzine+Sco，简写Hupz+Sco），除阴性对照组外，其他各组均采用东莨菪碱腹腔注射法建立记忆获得性障碍模型，每只鼠腹腔注射东莨菪碱0.7 mg·kg-1·d-1，连续7 d，阴性对照组腹腔注射等量0.9%生理盐水。每天采用跳台法进行跳台训练，24 h后复测。跳台法实验时，将小鼠放于跳台仪，适应5 min，通入36 V，2 mA交流电，记录小鼠受刺激后跳上绝缘平台的反应时间和5 min内的受电击次数，即错误次数。测定10 d后各组小鼠受电击次数。

2.2.2 给药方式 参照Linck V M[8]和Yoshiaki Sugawara[9]等的方法并改良，将薰衣草挥发油稀释于聚氧乙烯脱水山梨醇单油醇酯（Tween-80）中，分别配成体积百分比为1，2，3作为薰衣草挥发油低、中、高剂量组，通过放置在有机玻璃室（吸入装置）底部但不在动物触及范围内的电子蒸发器，将3组给药组小鼠分别暴露于相应的低、中和高剂量薰衣草挥发油蒸气中，每天控制60 min，连续10 d。有机玻璃室内每天以10%乙醇清洁。阳性对照组以石杉碱甲片0.07 mg·kg-1·d-1剂量灌胃方式给药，其他饲养条件各组一致。给药时间均为10 d。

2.2.3 脑组织生化指标测定 10 d后断颈脱臼法处死小鼠，迅速剥离大脑组织，分离大脑皮质和海马，并于冰浴生理盐水漂洗后滤纸拭干称重。加冰浴生理盐水匀浆，制成10%脑组织匀浆液，离心，取上清液进行各项生化指标测定，不能立即测定则冷冻于-20 ℃冰箱中备用。T-SOD，CAT，GSH-PX，MDA等检测均按照南京建成生物工程研究所提供的说明书配制溶剂并测定。脑组织蛋白浓度测定采用考马斯亮蓝法。

2.2.4 统计学处理 采用SPSS 19.0统计学软件对实验数据进行统计分析，所有结果表示为±s。使用单因素方差分析（ANOVA）进行统计分析。通过T检验确定差异性。

F值为P<0.05被认为具有统计学意义。

Pearson相关系数和回归分析用于评估抗氧化防御和脂质过氧化作用之间的联系。

3 结果与分析

3.1 薰衣草挥发油的成分分析

经水蒸气蒸馏法提取获得的薰衣草挥发油，为淡黄色澄清透明液体，具有薰衣草特有的清香韵。采用GC-MS技术测定，其总离子流，见图1。

由圖可知，薰衣草挥发油各成分出峰时间集中在5～18 min，含量最高的成分有2种，在离子流图中表现为平头峰，另有十余种含量较高的成分，除此以外，其他成分较多但含量均较低。GC-MS分析结果通过检索NIST08标准谱库及查阅相关文献鉴定薰衣草挥发油香气成分共55种，见表1。

从表1可以得出，芳樟醇和乙酸芳樟酯是薰衣草挥发油中的最主要成分，分别占薰衣草挥发油总量的24.56%和25.15%，乙酸薰衣草酯4.62%，樟脑0.48%。国家标准（GB/T 12653-2008）中对薰衣草油的要求，芳樟醇量在20%～43%，乙酸芳樟酯含量在25%～47%，乙酸薰衣草酯含量在0～8%，樟脑含量在0～1.5%，由此表明新疆产法国蓝薰衣草挥发油符合国家标准要求。对薰衣草挥发油的成分进行归类，见表2。

从表2中可知，薰衣草挥发油中主要的成分为萜烯、萜醇和酯类，占薰衣草挥发油总量的94.58%。酯类含量最高占35.53%，依次为乙酸芳樟酯、乙酸薰衣草酯和1-辛烯-3-醇乙酸酯，在薰衣草特征花香中香气贡献最大的组分。萜醇含量次之，占34.56%，主要由芳樟醇、4-萜品醇、α-松油醇和异龙脑等组成。萜烯类占24.3%，在植物挥发油中主要以单萜烯和倍半萜烯两种形式存在，β-蒎烯和β-罗勒烯是薰衣草挥发油中主要的单萜烯，α-檀香烯、β-石竹烯、荜澄茄油萜和（E）-β-金合欢烯是薰衣草挥发油中重要的倍半萜烯，具有消炎、止痛、抗组织胺和抗过敏等作用[10-13]，萜烯类不稳定，容易氧化导致薰衣草挥发油颜色变深。桉叶油醇是一种典型的醚类氧化物，在桉树、尤加利、月桂和茶树等精油中含量很高[10，14]。endprint

3.2 对记忆获得性障碍小鼠行为学与生化指标测定结果分析

3.2.1 行为学实验结果分析 小鼠跳台记忆能力测试，见图2，正常组小鼠5 min内触电次数1.5次，而模型组小鼠5 min内触电次数为6.04次，显著高于正常组小鼠。将经东莨菪碱作用后小鼠每天暴露于不同浓度的薰衣草挥发油蒸汽中60 min，持续10 d 后发现小鼠5 min内触电次数明显比模型组下降，在1.83～2.24次，具有显著的改善记忆能力效果，经统计分析，与正常對照组小鼠无显著差异（P<0.05）。

3.2.2 脑组织蛋白含量测定结果分析 模型组与3%薰衣草挥发油高剂量组存在显著差异（P< 0.05），模型组小鼠脑组织蛋白含量有适当下降，但与阴性对照组、薰衣草挥发油低、中剂量组以及石杉碱甲片阳性组均无统计学差异，见图3。

3.2.3 脑组织生化指标测定结果分析 不同浓度薰衣草挥发油蒸汽给药干预受东莨菪碱作用的小鼠记忆功能实验中，分析了小鼠脑组织中T-SOD，CAT，GSH-PX活性及MDA含量，测定结果见图4，5。

Control.阴性对照组；

Sco. 东莨菪碱组；

LVO1+Sco. LVO低剂量组；

LVO2+Sco. LVO中剂量组；

LVO3+Sco. LVO高剂量组；

Hupz+Sco. 石杉碱甲片组（图3～5同）。与单用东莨菪碱处理组相比**P<0.01（同图4～5）。

由图4可知，不同浓度薰衣草挥发油给药组（低、中、高剂量组）小鼠脑组织中GSH-PX，CAT，T-SOD水平均显著高于东莨菪碱模型组（P<0.01）， 其中低、中剂量组T-SOD水平低于空白对照组，而高剂量组高于空白对照组，但均无统计学差异。CAT和GSH-PX，薰衣草挥发油低、中、高剂量组和阳性药物石杉碱甲片组与空白对照组无统计学差异。据报道，东莨菪碱导致记忆障碍的机制之一是氧化损伤。MDA为脂质过氧化物，由氧自由基引发的脂质过氧化作用产生，氧自由基不仅通过生物膜中多不饱和脂肪酸的过氧化引起损伤，且能通过脂质氢过氧化物的分解产物引起细胞损伤，因此MDA含量常用于反映机体内脂质过氧化的程度，间接地反映出细胞损伤的情况。由图5可知，MDA在东莨菪碱模型组中达到最高，达到（10.01±0.97）μmoL·g-1 prot，与其他组均出现显著性差异（P<0.01），说明模型组小鼠在东莨菪碱作用下可能引起脑损伤，影响脑部功能。而经过1%和3%薰衣草挥发油或阳性药物治疗的小鼠脑组织中MDA的含量均低于正常组水平（无统计学差异），而2%的薰衣草挥发油则与正常组呈显著差异（P<0.05），体现了薰衣草挥发油显著的抗脑组织氧化活性。这个结果与行为学研究结果具有一致性，说明薰衣草挥发油或阳性药物石杉碱甲片均存在诱导神经元氧化应激减少的可能性，使记忆获得性障碍出现扭转的作用。

3.2.4 统计分析 采用SPSS 19.0软件对丙二醛MDA与总超氧化物歧化酶T-SOD、丙二醛MDA与过氧化氢酶CAT、丙二醛MDA与谷胱甘肽过氧化物酶GSH-PX之间的关系进行ANOVA方差与回归分析，结果发现MDA与T-SOD，MDA与CAT，MDA与GSH-PX之间均存在线性正相关关系，如图6所示。MDA与T-SOD之间拟合曲线为Y=157.642-6.908X（n=60，R2=0.614），MDA与CAT之间拟合曲线为Y=219.629-11.352X（n=60，R2=0.740），MDA与GSH-PX之间拟合曲线为Y=274.490-16.764X（n=60，R2=0.883），统计结果表明MDA与GSH-PX的相关性高于MDA与CAT的相关性，MDA与T-SOD的相关性较弱。

4 讨论

4.1 薰衣草挥发油的主要成分及其生物活性

芳樟醇和乙酸芳樟酯是法国蓝薰衣草挥发油的主要成分，另有D-苎烯、4-萜烯醇、桉叶油醇、异龙脑和石竹烯等含量较高的成分，与Gabrielal和Yap P S等报道基本一致[15-16]，但具体含量差异显著，如Gabrielal测定的薰衣草挥发油芳樟醇（32.52%）、樟脑（3.93%）含量显著高于本文结果，而乙酸芳樟酯（21.57%）、异龙脑（1.76%）和石竹烯（1.59%）等含量则相反。Yap P S等测定的薰衣草挥发油芳樟醇和乙酸芳樟酯含量占挥发油总量的72.98%，其他成分除石竹烯（4.81%）和异龙脑（2.57%）外，含量均为2%以下。薫衣草挥发油为植物次级代谢产物，随产地、季节、收货时间等不同而存在显著差异，因此也存在功能的差异性，应用中可根据具体用途选择薰衣草挥发油。

芳樟醇、乙酸芳樟酯、4-萜品醇等也是解痉镇痛[17]、抗菌[18-19]、抗抑郁[20]、消炎[21-22]等薰衣草挥发油功能发挥的主要成分之一。萜烯类在薰衣草挥发油中种类有26种，占24.3%，主要包括β-蒎烯、β-罗勒烯、α-檀香烯、β-石竹烯、荜澄茄油萜和（E）-β-金合欢烯等，含量较高的β-石竹烯（4.4%）可能是有效治疗癌症，焦虑和抑郁症的功能成分[22-23]，其他萜烯类功效尚未见报道。桉叶油醇是一种典型的醚类氧化物，在桉树油中含量很高，常作为皮肤渗透促进剂用于皮肤给药制剂中，且具有止咳、抗炎、保护胃粘膜等作用[10]。芳樟醇、乙酸芳樟酯、4-萜品醇、β-石竹烯和桉叶油醇等成分可能是薰衣草挥发油主要生物活性发挥的物质基础。

4.2 薰衣草挥发油改善记忆障碍相关研究

阿尔茨海默病是以记忆和认知进行性丧失为特征的年龄相关神经退行性疾病[24]，病理性特征为前脑胆碱能神经元的丧失和乙酰胆碱水平的明显下降[25]，导致破坏性认知障碍[26]，其临床症状主要表现为记忆障碍和空间记忆丧失[27-28]，目前国内外尚未发现功效显著的药物，常用药物以延缓生活技能丧失、心理安慰、改善失眠不安情绪等为主，如胆碱酯酶抑制剂、抗乙酰胆碱分解酵素、心理症状治疗和神经元保护剂等药物[29]。endprint

Lin等報道了薰衣草挥发油在痴呆症中的芳香疗法[30]，Lucian等研究了薰衣草挥发油对东莨菪碱诱导痴呆模型大鼠神经学能力的影响，结果表明，将AD模型大鼠多次暴露于薰衣草挥发油中，显著减少了大鼠焦虑和抑郁样行为，有效逆转了大鼠脑中胆碱能系统的功能障碍诱导的空间记忆缺陷[31]。Fang Y Z等发现多种疾病都与自由基对机体的氧化损伤有关[32]，自由基损伤理论是AD 衰老的主要学说，是导致其认知功能障碍的基本因素[33]。许多临床研究报道了氧化应激参与AD的发病机制[34-35]，痴呆动物模型中的记忆损伤与大鼠脑内增加的氧化应激相关[36]，氧自由基的存在可能是老年人AD发展的原因[37]。通过东莨菪碱建立小鼠AD模型，即通过东莨菪碱的氧化损伤作用使小鼠记忆功能衰退，出现神经退行性反应[38]。本研究结果表明，吸入薰衣草挥发油能改善东莨菪碱诱导的痴呆动物模型中的空间记忆缺陷，且使脑组织SOD，GPX和CAT等抗氧化酶参与的氧化应激减少，从而发挥对东莨菪碱诱导的痴呆病症中发生的氧化和自由基损伤的保护作用。

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[責任编辑 丁广治]endprint