新型塞来昔布衍生物的合成及其心血管风险的研究

林珊 王泽雨 杨建峰

[摘要] 目的 通过改造塞来昔布结构，降低其心血管副作用。

方法 在塞来昔布-CF3位置进行修饰，合成4种新型衍生物;利用液质、核磁等方法进行表征、确定结构;用角叉菜胶诱导的足肿胀36只Wistar大鼠，按体重随机分为6组，塞来昔布组（灌胃给予塞来昔布），化合物1、化合物2、化合物3、化合物4组（灌胃给予化合物1～4）（每日给药剂量为5 mg/kg，药物分散到0.5 mL羧甲基纤维素钠水溶液中），对照组（每日给0.5 mL羧甲基纤维素钠水溶液）。用药3 d取各组大鼠血清用酶联免疫吸附试验（ELISA）法测定环氧合酶-2（COX-2）和炎性因子白细胞介素-6（IL-6）的表达水平，用药7 d取血浆测定凝血因子的变化。

结果 与塞来昔布组比较，化合物1组COX-2水平变化差异无统计学意义（P > 0.05），化合物2～4组COX-2水平升高（P < 0.05）;与塞来昔布组比较，化合物1～4组IL-6水平变化差异无统计学意义（P > 0.05）;化合物2～4组凝血时间长于塞来昔布组（P < 0.05）。结论 化合物3和4在抑制炎性因子IL-6方面与塞来昔布相似的作用，但却对大鼠的凝血时间无明显的影响。因此，化合物3和4有望成为低心血管风险的塞来昔布衍生候选药物。

[关键词] 塞来昔布;衍生物;抗炎;凝血;心血管风险

[中图分类号] R971.1          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2020）02（a）-0008-07

[Abstract] Objective To reduce the cardiovascular side effects of Celecoxib by modification structure. Methods Four novel derivatives of Celecoxib were synthesized via substitutions of Celecoxib-CF3 group. The structures were identified and determined by the data of LC-MS and NMR spectrum. A total of 36 Wistar rats with foot swelling induced by carrageen glue were randomly divided into 6 groups according to the weight， Celecoxib group （lavage given Celecoxib）， compounds 1， 2， 3， 4 group （gastric gavage compounds 1-4） （a daily dose of 5 mg/kg， drug dispersed to 0.5 mL carboxymethyl cellulose sodium） ， the control group （0.5 mL daily to sodium carboxy methyl cellulose） aqueous solution. Serum levels of cyclooxygenase-2 （COX-2） and inflammatory factor interleukin-6 （IL-6） were determined by enzyme-linked immunoadsorption assay （ELISA） on 3 days after treatment， and serum levels of clotting factors were determined on 7 days after treatment. Results Compared with Celecoxib group， there was no significant difference in COX-2 levels in the compound 1 group （P > 0.05）， while COX-2 levels in compound 2 to 4 group were increased （P < 0.05）. Compared with the Celecoxib group， there were no significant differences in IL-6 levels in the compounds 1 to 4 group （P > 0.05）. The clotting time of compounds 2 to 4 group was longer than that of celecoxib group （P < 0.05）. Conclusion Compounds 3 and 4 have similar effects to Celecoxib in inhibiting the inflammatory factor IL-6， however there is no significant effect on the clotting time of rats. Therefore， compounds 3 and 4 are expected to be Celecoxib-derived drug candidates with low cardiovascular risk.

[Key words] Celecoxib; Derivatives; Anti-inflammatory; Blood coagulation; Cardiovascular risk

塞來昔布具有镇痛消炎及癌症抑制作用[1-8]。但近年发现其在使用中存在心血管病风险[9-13]，原因是塞来昔布特异性抑制环氧合酶-2（COX-2），从而抑制COX-2下游的前列腺素I2（PGI2）的合成，PGI2具有抑制血小板聚集和舒张局部微小血管的作用[14]，因此抑制PGI2会导致血小板聚集，引起血栓的形成，导致心血管病风险[15]。

塞来昔布是具有三环结构的邻二芳基杂环类化合物，其结构中的磺酰胺基团朝向COX-2特异性口袋，因此对COX-2具有较高的选择抑制性[16]。本研究是在塞来昔布的磺酰胺基团对位的-CF3位置增加取代基团，通过取代基团的牵引作用，适当调整磺酰胺基团对COX-2的结合力，以期在保持原有抗炎作用的同时，降低心血管风险。

1 材料与方法

1.1 实验材料

10周左右SPF级Wistar大鼠（180～200 mg，雌雄不分）由哈尔滨医科大学（大庆）提供，合格证号：SCXK（吉）-2018-0007;试剂均为分析纯，购于上海迈瑞及天津大茂试剂公司，批号见文中;角叉菜胶购于sigma公司;活化部分凝血酶时间（APTT）、凝血酶原时间（PT）试剂盒、大鼠COX-2酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒购于上海赫果公司;Mouse白细胞介素-6（IL-6） ELISA试剂盒购于博士德公司。

1.2 实验方法

1.2.1 化学合成[17]

1.2.1.1 化合物1的合成  1.24 g对甲基苯甲酸甲酯（批号：A1307024）、15 mL甲基叔丁基醚（MTBE）（批号：C10036450）加入三口瓶中搅拌并加入25%甲醇钠（批号：FCD00012179）（甲醇配制），搅拌2 min后逐滴加入1.11 g对甲基苯乙酮（15 mL MTBE溶解），95℃搅拌20 h（TLC检测），蒸除溶剂。加HCl溶解，用乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，过滤、蒸除溶剂，冷却得淡黄色固体（1a）2.09 g，未纯化备用。

圆底烧瓶中加1a，加20 mL乙醇，搅拌下加1.55 g对肼基苯磺酰胺盐酸盐（4-SAPH，批号：B020086），85℃回流20 h（溥层色谱法检测），蒸除溶剂。加乙酸乙酯和水萃取，分离有机相，饱和氯化钠洗涤、无水硫酸钠干燥，过滤、蒸除溶剂得黄色固体。柱色谱提纯（石油醚∶乙酸乙酯=50∶1、30∶1、10∶1、5∶1、3∶1），得浅黄色固体（化合物1），产率为69.5%。见图1（A）。

1.2.1.2 化合物2的合成  1.69 g 4-（三氟甲基）苯甲酸甲酯（批号：WZG110711-068N）于三口瓶中加MTBE，搅拌下加25%甲醇钠，搅拌2 min后逐滴加1.11 g对甲基苯乙酮（批号：C1004635），90℃搅拌20 h，产物处理方法同1a，冷却得白色固体（2a）2.45 g，未纯化备用。

圆底烧瓶中加2a，加20 mL乙醇，再加1.55 g 4-SAPH，80℃回流20 h，产物处理同化合物1，得黄色固体。柱色谱提纯（石油醚∶乙酸乙酯=10∶1、5∶1、3∶1、1∶1、1∶2），得黄色固体（化合物2），产率为71.5%。见图1（B）。

1.2.1.3 化合物3的合成  1.28 g对氯苯乙酮（批号：CJ260001）于三口瓶中加MTBE，搅拌下加25%甲醇钠，搅拌2 min后逐滴加MTBE溶解的1.24 g对甲基苯甲酸甲酯，85℃搅拌20 h，产物处理同1a，得到粉白色油状物，冷却后为粉白色固体（3a）2.39 g，未纯化备用。

圆底烧瓶中加3a，加20 mL乙醇，再加1.55 g 4-SAPH，80℃回流20 h，产物处理同化合物1，得黄色固体。柱色谱提纯（石油醚∶乙酸乙酯=100∶1、50∶1、30∶1、15∶1），得浅黄色固体（化合物3），產率为68.8%。见图1（C）。

1.2.1.4 化合物4的合成  1.28 g对氯苯乙酮于三口瓶中加MTBE，搅拌下加25%甲醇钠，搅拌2 min后逐滴加1.69 g 4-（三氟甲基）苯甲酸甲酯，90℃搅拌20 h，按1a方法处理，得到深黄色固体（4a）2.58 g，未纯化备用。

圆底烧瓶中加4a，加20 mL乙醇，再加3.704 g 4-SAPH，80℃回流20 h，产物处理方法同化合物1，得黄色固体。柱色谱提纯（石油醚∶乙酸乙酯=15∶1、10∶1、5∶1、2∶1），得黄色固体（化合物4），产率为67.1%。见图1（D）。

1.2.2 表征

1.2.2.1 熔点测定  样品放入钳锅中，于差示扫描量热仪（HSC-2/3/4，北京恒久）中测熔点。

1.2.2.2 液相-质谱联用仪分析（LC-MS）  样品溶于二甲基亚砜，用液质联用仪（LCT Premier XE，Waters）测定。

1.2.2.3 核磁表征  样品放EP管中，加入氘代二甲亚砜涡旋均匀，放核磁管中待测。

1.2.3 动物实验

1.2.3.1 炎症模型动物及给药  Wistar大鼠在常温下自由进食和水。24 h后，每只鼠右后足趾皮下注射1%角叉菜胶0.1 mL，观察24 h，取36只诱导成功的爪水肿炎症模型鼠，随机分为6组，塞来昔布组、化合物1组、化合物2组、化合物3组、化合物4组每日分别给相应药物（5 mg/kg，药物分散至0.5 mL羟甲基纤维素钠水溶液中），对照组每日给予0.5%羧甲基纤维素水溶液0.5 mL，连续灌胃给药3 d。最后1天给药后分别在0、4、8、12、24 h眼眶取血，10 000 g低温离心，离心机半径2 cm，得血清用于COX-2和IL-6测定。继续灌胃给药至第7天，心脏取血，分离血浆，用于APTT、PT测定。

1.2.3.2 COX-2和IL-6的测定  分别取“1.2.3.1”各个时间段眼眶取血得到的血清用ELISA法检测血清中COX-2[18-19]及IL-6的水平[18]。

1.2.3.3 APTT、PT测定  半自动血凝仪（HF6000-4，海力孚公司），预温至37℃，测定“1.2.3.1”步骤中得到的各组心脏血浆的APTT和PT[20-23]。

1.3 统计学方法

用统计软件 SPSS 22.0对数据进行分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组组间采用t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结构表征

化合物1：熔点185～190℃;分子量（m/z）：404.14 [M+1]+;1H NMR（DMSO）δ：2.34（3H，s，CH3），2.34（3H，s，CH3），7.12（1H，s，吡唑环CH），7.27（2H，s，NH2），7.85（2H，d，苯环CH），7.83（2H，d，苯环CH），7.51（2H，d，苯环CH），7.46（2H，d，苯环CH），7.22（2H，d，苯环CH），7.22（2H，d，苯环CH）。见图1。

化合物2：熔点135～140℃;分子量（m/z）：458.11 [M+1]+;1H NMR（DMSO）δ：2.35（3H，d，CH3），7.49（1H，s，吡唑环CH），7.30（2H，s，NH2），7.87（2H，d，苯环CH），7.84（2H，d，苯环CH），7.56（2H，d，苯环CH），7.56（2H，d，苯环CH），8.16（H，d，苯环CH），7.81（H，d，苯环CH），7.24（2H，d，苯环CH）。见图3。

化合物3：熔点165～170℃;分子量（m/z）：424.08[M+1]+;1H NMR（DMSO）δ：2.34（3H，d，CH3），7.48（1H，s，吡唑环CH），7.22（2H，s，NH2），7.86（2H，d，苯环CH），7.53（2H，d，苯环CH），7.96（H，d，苯环CH），7.83（H，d，苯环CH），7.51（2H，d，苯环CH），7.21（2H，d，苯环CH），7.36（H，d，苯环CH），7.29（H，d，苯环CH）。见图4。

化合物4：熔点130～135℃;分子量（m/z）：478.05 [M+1]+;1H NMR（DMSO）δ：7.49（1H，s，吡唑环CH），7.38（2H，s，NH2），7.89（2H，d，苯环CH），7.83（2H，d，苯环CH），7.57（2H，d，苯环CH），7.57（2H，d，苯环CH），8.17（H，d，苯环CH），7.98（H，d，苯环CH），7.53（2H，d，苯环CH）。

经分析，塞来昔布和化合物1～4结构。见图6。

2.2 各用药组血清COX-2水平比较

利用COX-2标准物作COX-2浓度与吸光度标准曲线（图7），线性拟合得直线Y = 0.0091X+0.1977（r = 0.999），各组大鼠血清按试剂盒指示处理并测其吸光度，代入方程得相应COX-2表达浓度，在4、8、12、24 h时间点各组与对照组比较，大鼠血清中COX-2水平均降低（P < 0.05）;与塞来昔布组比较，化合物1组COX-2水平差异无统计学意义（P > 0.05），化合物2～4组COX-2水平高于塞来昔布组（P < 0.05）。化合物1～4组和塞来昔布组组内各时间段COX-2水平比较，差异均有统计学意义（P < 0.05），其中各药物组在24 h时间点时COX-2的水平最低（P < 0.05）。见表1。

2.3 各用药组炎性因子IL-6水平

化合物1～4组、塞来昔布组与对照组比较，在4～24 h IL-6水平显著降低（P < 0.05）;但化合物1～4组与塞来昔布组比较，差异无统计意义（P > 0.05）;化合物1～4组和塞来昔布组组内各时间段比较，IL-6水平差异均有统计学意义（均P < 0.05），其中各药物组在12 h时间点时IL-6的水平最低（P < 0.05）。见表2。

2.4 各用药组对APTT、PT的影响

塞来昔布组、化合物1～2组APTT和PT明显短于对照组（P < 0.05），化合物3～4组APTT和PT与对照组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）;化合物1组与塞来昔布组比较，APTT、PT差异无统计学意义（P > 0.05）;化合物2～4组APTT和PT长于塞来昔布组（P < 0.05）。见表3。

3 讨论

塞来昔布是COX-2特异性抑制剂，但在使用中存在心血管风险[24]。本研究对塞来昔布结构进行改造，在磺酰胺基对位取代，以取代基的牵扯力，适当降低对COX-2的抑制作用。實验结果显示，-CF3被对氯苯基取代后能适当降低母核塞来昔布对COX-2的抑制作用，可能是对氯苯基与其位置上的氨基酸的作用力比-CF3强。

因COX-2正常情况下不表达，只有在炎症状态下高表达，因此动物注射角叉胶制造炎症模型以用于表征塞来昔布组与衍生物组对炎症的抑制作用。通过COX-2的表达和IL-6因子测量显示，化合物2～4对COX-2的抑制较塞来昔布有所降低（P < 0.05），但IL-6炎性因子水平差异无统计学意义（P > 0.05），提示通过衍生化适当降低对COX-2的特异抑制，没有影响对炎症的治疗作用。

塞来昔布及其衍生物均通过抑制COX-2从而抑制其下游PGI2水平，降低凝血作用，本实验测定大鼠用药7 d后APTT和PT的变化情况，发现化合物3、4组对凝血时间影响较塞来昔布组及化合物1组明显延长（P < 0.05），基本达到对照组的正常凝血时间。提示衍生物3、4虽然也通过COX-2抑制了PGI2的水平，但大大降低了塞来昔布对凝血的影响。

本研究用模拟设计的思路在塞来昔布作用于COX-2特异口袋的磺酰胺基的对位进行苯环和氯苯等基团的取代，得到4个新型塞来昔布衍生物，COX-2及IL-6测试提示，化合物3和4适当降低了对COX-2的抑制，保留了与塞来昔布相似的炎症抑制作用，但明显降低了对凝血因子的影响，将凝血时间提高到正常水平。化合物3和4有望成为降低塞来昔布心血管风险的候选化合物。

[参考文献]

[1]  Li Q，Peng J，Liu T，et al. Effects of celecoxib on cell apoptosis and Fas，FasL and Bcl-2 expression in a BGC-823 human gastric cancer cell line [J]. Exp Ther Med，2017，14（3）：1935-1940.

[2]  Wang G，Li J，Zhang L，et al. Celecoxib induced apoptosis against different breast cancer cell lines by down-regulated NF-κB pathway [J]. Biochem Biophys Res Commun，2017，490（3）：969-976.

[3]  Kelly JD，Tan WS，Porta N，et al. BOXIT-A Randomised Phase Ⅲ Placebo-controlled Trial Evaluating the Addition of Celecoxib to Standard Treatment of Transitional Cell Carcinoma of the Bladder （CRUK/07/004） [J]. Eur Urol，2019，75（4）：593-601.

[4]  Tai Y，Zhang LH，Gao JH，et al. Suppressing growth and invasion of human hepatocellular carcinoma cells by celecoxib through inhibition of cyclooxygenase-2 [J]. Cancer Manag Res，2019，9（11）：2831-2848.

[5]  Egashira I，Takahashi-Yanaga F，Nishida R，et al. Celecoxib and 2，5-dimethylcelecoxib inhibit intestinal cancer growth by suppressing the Wnt/β-catenin signaling pathway [J]. Cancer Science，2017，108（1）：108-115.

[6]  Mojeiko G，de Brito M，Salata GC. Combination of microneedles and microemulsions to increase celecoxib topical delivery for potential application in chemoprevention of breast cancer [J]. Int J Pharm，2019，5（560）：365-376.

[7]  Tian J，Guo F，Chen Y，et al. Nanoliposomal formulation encapsulating celecoxib and genistein inhibiting COX-2 pathway and Glut-1 receptors to prevent prostate cancer cell proliferation [J]. Cancer Lett，2019，28（448）：1-10.

[8]  Li J，Hao Q，Cao W，et al. Celecoxib in breast cancer prevention and therapy [J]. Cancer Manag Res，2018，26（10）：4653-4667.

[9]  Martín Arias LH，Martín González A，Sanz Fadrique R，et al. Cardiovascular Risk of Nonsteroidal Anti-inflammatory Drugs and Classical and Selective Cyclooxygenase-2 Inhibitors：A Meta-analysis of Observational Studies [J]. J Clin Pharmacol，2019，59（1）：55-73.

[10]  Patrono C. Cardiovascular Effects of Cyclooxygenase-2 Inhibitors：A Mechanistic and Clinical Perspective [J]. Br J Clin Pharmacol，2016，82（4）：957-964.

[11]  楊鹰，孙茹，曹艳花.选择性环氧合酶-2抑制剂对心血管影响的研究进展[J].药学研究，2016，35（1）：41-45.

[12]  潘伟.幽门螺杆菌感染和胃泌素、环氧合酶-2与结直肠腺瘤性息肉的相关性[J].中国现代医生，2019，57（1）：23-27，封3.

[13]  Nissen SE，Yeomans ND，Solomon DH，et al. Cardiovascular Safety of Celecoxib，Naproxen，or Ibuprofen for Arthritis [J]. N Engl J Med，2016，375（26）：2519-2529.

[14]  王泽雨，林珊，宗鸣，等.以环氧合酶（Cox）为靶点的药物设计中注意的几个平衡问题[J].黑龙江八一农垦大学学报，2018，3（1）：59-64.

[15]  Stitham J，Hwa J. Prostacyclin，Atherothrombosis and Diabetes Mellitus：Physiologic and Clinical Considerations [J]. Curr Mol Med，2016，16（4）：328-342.

[16]  Abdellatif KRA，Abdelall EKA，Labib MB，et al. Design，synthesis of celecoxib-tolmetin drug hybrids as selective and potent COX-2 inhibitors [J]. Bioorg Chem，2019，3（90）：103 029-103 030.

[17]  You S，Jiadi D，Hong C. Synthesis of Celecoxib，its Pro-drugs and Radiolabeled Derivatives. A Brief Review [J]. Org Prep Proced Int，2014，46（15）：132-151.

[18]  王靳琎，杨晓梅，苏丽万，等.海带多糖对脂多糖致慢性炎症大鼠血管内皮的保护作用[J].中国药理学通报，2018， 5（1）：651-656.

[19]  赵美璇，何秀萍.环加氧酶-2及其抑制剂与卵巢癌关系的研究进展[J].医学综述，2019，25（19）：3823-3827.

[20]  Li ZL，Ye SB，OuYang LY，et al. COX-2 promotes metastasis in nasopharyngeal carcinoma by mediating interactions between cancer cells and myeloid-derived suppressor cells [J]. Oncoimmunology，2015，4（11）：e1044712.

[20]  陈渊博，芦娟.血小板参数和凝血指标水平变化在肝硬化患者中的临床意义[J].首都食品与医药，2019，26（11）：62-63.

[21]  余俊，刘彤鸥，李晓兰，等.miR-622在上皮性卵巢癌组织中表达及与预后的关系[J].成都医学院学报，2018， 13（1）：74-77.

[22]  陈涛，石秀娥，柳靈，等.甲状腺功能异常患者出凝血功能指标变化的临床研究[J].中国医药导报，2018，15（20）：105-107，111.

[23]  蒋宏辉，何华，赖春进，等.血小板参数和红细胞参数与心肌梗死的相关性研究[J].中国医药科学，2018，8（3）：209-211，230.

[24]  Shin S. Safety of celecoxib versus traditional nonsteroidal anti-inflammatory drugs in older patients with arthritis [J]. J Pain Res，2018，11（1）：3211-3219.

（收稿日期：2019-05-23  本文编辑：刘永巧）