基于一种荧光探针的5-脂氧酶抑制剂筛选体系的建立
时间：2021-01-25 02:01:37 来源：达达文档网 本文已影响 人 
张潇丹
【摘要】目前5-脂氧酶抑制劑的筛选方法有放免法、HPLC法和比色法等，但因实验条件、价格或灵敏度等原因并不适合体外高通量初筛。本文基于5-脂氧酶代谢底物中产生的脂质自由基可使探针二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯发生转化产生荧光的机理，建立了一种细胞水平的5-脂氧酶抑制活性分析的体系，采用阳性药物咖啡酸来验证方法可靠性。
【关键词】荧光探针 5-脂氧酶抑制剂 筛选
5-脂氧酶介导细胞内源性花生四烯酸（Arachidonic acid，AA）氧化产生的白三烯与哮喘、关节炎、肠道炎症等许多炎性疾病的发生和发展密不可分。研究发现，5-脂氧酶代谢AA过程中产生大量氢过氧化物。本文将基于白细胞内5-脂氧酶代谢AA产生的脂质自由基可使DCFH探针氧化生成发荧光的DCF探针的机理，建立一种适用于细胞水平的5-脂氧酶抑制剂体外高通量筛选方法。
一、实验部分
（一）仪器与试剂
奥林巴斯荧光显微镜（IX71，日本奥林巴斯株式会社）;多功能酶标仪（SynergyTM HT，Bio-Tek）。
三磷酸腺苷（ATP，重庆川东化工有限公司）;花生四烯酸（sigma，USA）;二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯（DCFH-DA，sigma，USA）;咖啡酸（Caffeic acid，成都普思生物科技有限公司，纯度>98%）;以上均用PBS缓冲液配制。HBSS溶液（Hyclone，USA）;人外周血白细胞（106cells/mL）。
（二）实验方法
1.5-脂氧酶活性测试体系的优化及建立
如表1，往106cells/mL的白细胞悬液中加入不同试剂形成对照组、实验组。其中，荧光探针DCFH-DA终浓度10μmol/L，AA70μmol/L、CaCl22.5mmol/L，ATP2mmol/L。均置于37℃、5%CO2培养箱中孵育30min，离心洗涤3次，HBSS缓冲液重悬后接种于96孔板。于488nm激发波长和525nm发射波长进行荧光检测，测定0min和90min的荧光值。每组6个平行，实验重复三次。
2.阳性对照物咖啡酸测试
采用咖啡酸作阳性对照物，如表2所示，往106cells/mL的白细胞悬液中加入不同试剂形成实验组、对照组。荧光检测，测定0～90min的荧光值变化。每组6个平行，实验重复三次。
二、结果与讨论
（一）荧光探针法测定5-脂氧酶活性影响因素分析
如图1所示，缺少DCFH-DA，体系无荧光;缺少细胞，体系仅仅表现出探针自身的微弱荧光;相比于Complete组，缺少ATP，体系荧光值减弱35%;缺少CaCl2，减弱15%;缺少AA，减弱81%。加入AA与否，体系的荧光强度值差别很大，说明AA的存在对该反应体系是必要的，这应与该酶反应体系具底物特异性的性质有关。而Ca2+与5-脂氧酶的激活密不可分，而ATP更是酶反应的能量供应者。因此，Ca2+和ATP的存在对该酶反应体系有影响，表现为缺少时体系荧光有变化。但该变化表现为减弱15%和35%，或与细胞内存在内源性钙离子和ATP有关。
如图2所示，荧光探针DCFH-DA本身无荧光，可自由穿过细胞膜，进入后被白细胞内的酯酶水解成无荧光的DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而实现荧光探针在细胞内的装载。5-脂氧酶催化AA产生二十碳酸类化合物，与白细胞中内源性的ROS（Reactive oxygen species）一样，其可将不发荧光的DCFH分解为发荧光的DCF。在底物AA过量情况下，通过测定荧光变化值可以间接反应5-脂氧酶的酶催化效率。在5-脂氧酶高表达的细胞内，5-脂氧酶信号远远大于细胞内源性ROS信号，所以探针表现出5-脂氧酶依赖性。
（二）阳性对照物测试
采用咖啡酸作为阳性对照物测试，荧光仪测得体系荧光值随时间的变化曲线（图3），实验Caffeic acid组的白细胞平均相对荧光强度-时间曲线要远远低于对照Complete组，甚至低于空白ROS组（图3插图）。这说明咖啡酸不仅抑制了白细胞内二十碳酸类化合物等脂质自由基的产生，还强烈的抑制了细胞内活性氧自由基。
三、结论
本文建立了一种适于体外高通量筛选的5-脂氧酶抑制剂筛选体系：荧光探针DCFH-DA本身无荧光，可自由穿过细胞膜，进入细胞后，可被酯酶水解生成无荧光的DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而实现荧光探针在细胞内的装载。利用5-脂氧酶催化AA产生的二十碳酸类化合物可将无荧光的DCFH分解为发荧光的DCF的能力，通过外加酶反应底物及反应所需的ATP和Ca2+等，放大细胞内的酶反应过程，排除细胞内源性ROS的影响，从而实现药物对5-脂氧酶活性影响的检测。采用咖啡酸作阳性对照物进行了可靠性测试，信号明显，有望在5-脂氧酶抑制剂筛选上发挥价值。
参考文献：
[1]Cai， H; Huang， XJ; Xu， ST.et.al. Discovery of novel hybrids of diaryl-1，2，4-triazoles and caffeic acid as dual inhibitors of cyclooxygenase-2 and 5-lipoxygenase forcancer[J]. European Journal of Medichinal Chemistry.2016，108：
89 – 103.
[2]Stephen L. Hempel， Garry R. Buetiner， Yunxia Q. Omalley， et.al. Dihydrofluorescein diacetate is superior for detecting intracellular oxidants：
comparison with 2"，7"- dichlorodihydrofluorescein diacetate， 5 （and 6）-carboxy-2"，7"-dichlorodihydrofluoreacein diacetate， and dihydrorhodamine 123[J]. Free Radical Biology & Medicine， 1999， 27（2）：
146–159.
