γ-干扰素释放试验联合斑点形成细胞及ELISPOT诊断活动性结核与潜伏性结核的研究

李玉美　陈胤文　余晓琳　洪建明　林炳耀　曾今诚　林东子

【摘要】 目的：探究γ-干扰素释放试验（interferon-γ release assays，IGRAs）联合可产生γ-干扰素（interferon-γ，INF-γ）的斑点形成细胞（spot-forming cells，SFC）数量、酶联免疫斑点检测法（enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT）模型识别活动性结核与潜伏性结核的诊断效能。方法：选取2017年9月-2018年12月在笔者所在医院就诊的结核分枝杆菌感染患者312例，其中活动性肺结核组154例记为活动组，潜伏性结核分枝杆菌感染158例记为潜伏组。通过受试者工作特征曲线（ROC曲线）分析γ-干扰素释放试验、SFC及ELISPOT联合诊断模型识别活动性及潜伏性结核的诊断价值。结果：活动组γ-干扰素释放试验结果高于潜伏组，SFC高于潜伏组，ELISPOT阳性率（78.6%）高于潜伏组（31.0%），差异均有统计学意义（P<0.05）。γ-干扰素释放试验诊断的临界值为2.72 IU/ml，其对应灵敏度为79.1%，特异度为52.5%，ROC曲线下面积为0.768[95%CI（0.708，0.829）];SFC诊断临界值为2.78，其对应的灵敏度为75.3%，特异度为60.8%，ROC曲线下面积为0.768[95%CI（0.711，0.825）];ELISPOT阳性诊断临界值为4.27 mg/L，其对应灵敏度为70.8%，特异度为51.3%，ROC曲线下面积为0.620[95%CI（0.546，0.694）]。行Logistic回归分析，得到联合诊断模型Logit（P）=1.433+2.512γ-干扰素释放试验+1.654 SFC+1.121 ELISPOT，联合检测截断值为2.47，对应灵敏度为74.7%，特异度为80.4%，ROC曲线下面积为0.851[95%CI（0.806，0.896）]。联合检测特异度及曲线下面积均高于各指标单独检测，差异均有统计学意义（P<0.05），且联合检测保持较好的灵敏度。结论：γ-干扰素释放试验、SFC及ELISPOT联合诊断模型可提高活动性结核的特異度，并保持较高的灵敏度，在鉴别活动性及潜伏性结核感染方面具有重要的临床价值。

【关键词】 活动性结核病 γ-干扰素释放试验 酶联免疫斑点检测法 斑点形成细胞 联合诊断

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2020.21.006 文献标识码 A 文章编号 1674-6805（2020）21-00-04

Diagnostic Value of Interferon-γ Release Assays Combined with Spot-forming Cells and Enzyme-linked Immunospot Assay in Active and Latent Tuberculosis/LI Yumei， CHEN Yinwen， YU Xiaolin， HONG Jianming， LIN Bingyao， ZENG Jincheng， LIN Dongzi. //Chinese and Foreign Medical Research， 2020， 18（21）：
14-17

[Abstract] Objective：
To explore the diagnostic value of Spot-forming cells （SFC） and enzyme linked immunospot assay （ELISPOT） in combination with interferon-γ release assays （IGRAs） in active and latent tuberculosis. Method：
A total of 312 patients with mycobacterium tuberculosis infection who visited our hospital from September 2017 to December 2018 were selected. Among them， 154 patients in the active tuberculosis group and 158 patients with latent mycobacterium tuberculosis infection were recorded as the latent group. The diagnostic value of IFN-γ release test， SFC and ELISPOT combined diagnostic model in active and latent tuberculosis was analyzed by ROC curve. Result：
The result of IFN-γ release test in the active group was higher than that in the latent group， the level of SFC in the active group was higher than that in the latent group， the positive rate of ELISPOT in the active group （78.6%） was higher than that in the latent group （31.0%）， the differences were statistically significant （P<0.05）. The diagnostic threshold of IFN-γ release test was 2.72 IU/ml， the corresponding sensitivity was 79.1%， the specificity was 52.5%， and the area under ROC curve was 0.768 [95%CI （0.708， 0.829）]. The diagnostic threshold of SFC diagnosis was 2.78， the corresponding sensitivity was 75.3%， the specificity was 60.8%， and the area under ROC curve was 0.768 [95%CI （0.711， 0.825）]. The diagnostic threshold of positive diagnosis of ELISPOT was 4.27 mg/L， the corresponding sensitivity was 70.8%， the specificity was 51.3%， and the area under ROC curve was 0.620 [95%CI （0.546， 0.694）]. The combined diagnosis model Logit （P）=1.433+2.512 γ-interferon release test+1.654 SFC+1.121 was obtained by logistic regression analysis， and the diagnostic threshold of combined diagnosis model was 2.47， and the sensitivity of it was 74.7%， the specificity was 80.4%， and the area under ROC curve was 0.851 [95%CI （0.806， 0.896）]. The specificity and the area under the curve of combined detection were higher than those of individual detection， the differences were statistically significant （P<0.05）， and the combined detection maintained good sensitivity. Conclusion：
IFN-γ release test， SFC and ELISPOT combined diagnosis model can improve the specificity of active tuberculosis， and maintain high sensitivity， which has important clinical value in distinguishing active and latent tuberculosis infection.

[Key words] Active tuberculosis Interferon-γ release assays Enzyme-linked immunospot assay Spot-forming cells Combination diagnosis

First-authors address：
The Sixth Peoples Hospital， Dongguan 523008， China

近年來，随着经济的发展，人口迁徙空前加快，增加了结核病的传播机会[1]，据报道，中国的结核分枝杆菌携带者的比例为13%～20%[2]。如果不经治疗，其中约5%的结核菌携带者将发展为活动性结核病[3]。虽然当前有多种检测结核病的方法，但是灵敏度和特异性还不能满足临床的要求[4]。γ-干扰素（IFN-γ）释放试验是一种新的用于辅助诊断结核感染的免疫学方法，其灵敏度和特异性均显著优于传统方法，使其在临床上得以广泛应用[5]。然而，IFN-γ释放试验（interferon-γrelease assays，IGRAs）不可区分活动性结核病和潜伏性结核分枝杆菌感染[6]。由于抗结核治疗有副作用，准确识别活动性结核病和潜伏性结核分枝杆菌感染对临床上决定是否采取治疗措施十分重要。本研究拟综合使用IFN-γ释放水平及产生γ-干扰素的T细胞数量即斑点形成细胞（sport-forming cells，SFC）、酶联免疫斑点检测法（enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT）来建立一个模型，来用于活动性结核病和潜伏性结核分枝杆菌感染的识别，探讨其临床可行性，具体如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年9月-2018年12月在笔者所在医院就诊的结核分枝杆菌感染患者312例，其中活动性肺结核组154例记为活动组，潜伏性结核分枝杆菌感染158例记为潜伏组。活动组纳入标准：抗酸染色检测、结核分枝杆菌PCR检测或分枝杆菌培养检测阳性;且有明显结核相关症状。活动组排除标准：已进行2周以上抗结核治疗;依从性差、复诊或随访困难;年龄小于16岁或大于65岁;妊娠期;合并肺外结核病（结核性胸膜炎除外）;抗酸染色（+）但PCR（-），怀疑为非结核分枝杆菌感染;人类免疫缺陷病毒感染。潜伏组纳入标准：与活动性结核患者密切接触，结核菌素实验阳性，但无咳嗽、咳痰、发热、盗汗等临床表现，同时无影像学证据支持肺结核诊断。潜伏组排除标准：依从性差、复诊或随访困难;年龄小于16岁或大于65岁;妊娠期;不明原因的感染性疾，包括怀疑为非结核分枝杆菌感染及HIV感染;自身免疫性疾病;有结核病史;ICU病房患者及肿瘤患者;使用免疫抑制剂;人类免疫缺陷病毒感染。活动组男88例，女66例，平均年龄（57.12±10.74）岁;潜伏组男89例，女69例，平均年龄（59.43±11.28）岁。两组性别、年龄比较差异无统计学意义（字2=0.020，P=0.885;t=0.852，P=0.065）。本研究通过医院伦理委员会审阅同意，所有患者均签署知情同意书。

1.2 方法与观察指标

γ-INF释放试验：入组后抽取患者外周静脉血3 ml，肝素管抗凝，在空白对照管N，测试管T和阳性对照管P各加入1 ml全血样本（管经肝素抗凝处理），在血液采集4 h内将各管放入（37±1）℃恒温培养箱中培养16～24 h，后以3 000～5 000 r/min的转速离心10 min，取血浆检测各培养管中γ-干扰素的浓度。高于诊断最佳截断值，则定位阳性。

ELISPOT及SFC测定：入组后抽取患者外周静脉血3 ml，肝素管抗凝，分离外周血单个核细胞并测定细胞浓度，测定经分泌靶抗原-6及培养滤液蛋白-10融合蛋白刺激下产生γ-INF的T-细胞数量（即SFC），与阴性对照孔相比，得出ELISPOT阳性率。判定标准：ELISPOT阳性率，每孔20万单个核细胞的阴性对照孔斑点数为0～5时，则测试孔SFC与对照孔SFC之差≥6为阳性;若阴性对照孔斑点数≥6，则测试孔SFC的值大于2倍对照孔SFC的值为阳性。ELISPOT分析仪为德国Autoimmun diagnostika公司生产，γ-INF ELISPOT试剂盒操作严格按照操作标准（批号：1605023，上海江莱生物科技有限公司产）。

1.3 统计学处理

数据处理采用SPSS 19.0统计软件，符合正态分布的计量资料以（x±s）表示，采用独立资料t检验;不符合正态分布的计量资料以中位数（四分位数）[M（P25，P75）]表示，采用Mann-Whitney U检验;计数资料以率（%）表示，比较用字2检验。运用Logistic回归拟合联合诊断模型并绘制ROC曲线评估诊断价值，采用Hanley-McNeil方法比较ROC曲线下面积，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组γ-干扰素、SFC及ELISPOT阳性率比较

活动组γ-干扰素释放试验结果高于潜伏组，SFC高于潜伏组，ELISPOT阳性率（78.6%）高于潜伏组（31.0%），差异均有统计学意义（P<0.05），见表1。

2.3 各组γ-干扰素释放水平、SFC及ELISPOT结果单独和联合诊断效能比较

以血清γ-干扰素释放水平、SFC及ELISPOT阳性结果作为检验变量，有无活动性结核病为状态标量，以1-特异度为X轴，以灵敏度为Y轴绘制ROC曲线，见图1，以确定最佳截断值。根据ROC曲线可得，γ-干扰素释放试验诊断的临界值为2.72 IU/ml，其对应的灵敏度为79.1%，特异度为52.5%，ROC曲线下面积为0.768[95%CI（0.708，0.829）];SFC诊断的临界值为2.78，其对应的灵敏度为75.3%，特异度为60.8%，ROC曲线下面积为0.768[95%CI（0.711，0.825）];ELISPOT阳性诊断的临界值为4.27 mg/L，其对应的灵敏度为70.8%，特异度为51.3%，ROC曲线下面积为0.620[95%CI（0.546，0.694）];随后以活动性结核的发生情况（赋值：发生=1，未发生=0）为因变量，以γ-干扰素释放水平、SFC及ELISPOT阳性结果为自变量，进行Logistic回归分析，得到回归方程为Logit （P）=1.433+2.512γ-干扰素释放试验+1.654 SFC+1.121 ELISPOT，模型中概率值变量pre-1=1/{1+exp[-Logit （P）]}，并根据Logistic回归模型中的概率值pre-1拟合联合ROC曲线，联合检测最佳诊断截断值为2.47，灵敏度为74.7%，特异度为80.4%，ROC曲线下面积为0.851[95%CI（0.806，0.896）]。联合检测特异度及曲线下面积均高于各指标单独检测，差异均有统计学意义（P<0.05），且联合检测保持较好的灵敏度，见表2、表3。

3 讨论

我国是结核大国，结核感染率在世界排名第二位，结核的药物治疗对机体损伤较大，因此需要建立高效的诊断方法进行活动性结核及潜伏性结核的鉴别[7]。γ-干扰素释放实验是临床上确认结核感染和评估较为常用的方法，能较为灵敏和准确地鉴定结核的感染，但是在区分潜伏性结核和活动性结核方面尚存在不足，需要探索更好地鉴别诊断方法[5]。既往研究中SFC及ELISPOT阳性率在鑒别潜伏性结核和活动性结核显示出一定成效[8-9]，本研究探讨了γ-干扰素释放试验、SFC及ELISPOT联合诊断模型鉴别活动和潜伏结核病的临床价值。

γ-干扰素释放试验是一种较新的结核病诊断方法，通过抗原刺激致敏淋巴细胞产生的干扰素水平来确定是否有结核分枝杆菌的感染[10]。在本实验中，γ-干扰素释放试验诊断的灵敏度为79.1%，特异度为52.5%，ROC曲线下面积为0.768[95% CI（0.708，0.829）]。谢莉等[11]研究表明γ-干扰素释放试验诊断活动性结核的敏感度和特异度分别为84%、62%，高于本实验;但两者样本人群、样本量存在较大差异。本实验中γ-干扰素释放试验在鉴别潜伏性和活动性结核方面价值有限，主要是特异度较低，单一诊断依据可能造成误诊，使一部分患者接受了结核治疗对机体产生危害。因此，γ-干扰素释放试验作为单一的诊断依据价值有限，需要和其他方法相结合提高诊断效能。

ELISPOT是采用干扰素释放试验技术，通过测定抗原刺激下产生干扰素的斑点数量，以此判断是否结果为阳性;并同时确定SFC的数量[12]。在活动性结核中，机体受到结核分枝杆菌的抗原刺激较多，免疫系统较为活跃，可产生较多的致敏T细胞，这是其鉴别活动性结核和潜伏性结核的理论基础[13]。在本实验中，SFC诊断的灵敏度为75.3%，特异度为60.8%，ROC曲线下面积为0.768[95%CI（0.711，0.825）];ELISPOT阳性诊断的灵敏度为70.8%，特异度为51.3%，ROC曲线下面积为0.620[95%CI（0.546，0.694）]，两种方法灵敏度较好。史会影等[14]研究了ELISPOT实验诊断活动性结核的效能，敏感性及特异性均达80%，与本研究结果相比较高，可能是由于样本人群结核感染情况存在一定差异。SFC及ELISPOT是诊断活动性结核的重要方法，灵敏度尚可，但单独诊断价值有限，需要联合其他方法提高诊断特异度，以减少误诊情况。

既往研究表明联合多种方法诊断活动性结核提高其检出率[15-16]。在本实验中，三者联合诊断活动性结核的灵敏度为74.7%，特异度为80.4%，ROC曲线下面积为0.851（95%CI 0.806，0.896）。联合检测特异度显著高于各指标单独检测（P<0.05），且保持较好的灵敏度，联合诊断的曲线下面积显著高于各项指标单独检测（P<0.05）。表明联合诊断可提高活动性结核病的诊断准确度，具有较好的临床应用前景。通过构建γ-干扰素释放试验、SFC及ELISPOT联合诊断模型提高了活动性结核诊断的特异度，也明显提高了诊断效能。

综上所述，γ-干扰素释放试验、SFC及ELISPOT联合诊断模型可提高活动性结核的特异度，并保持较高的灵敏度，在鉴别活动性及潜伏性结核感染方面具有重要的临床价值。

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（收稿日期：2020-04-24） （本文编辑：马竹君）