疳积合剂等制剂质量标准提高的研究

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摘要：目的通过薄层色谱鉴别（TLC）、高效液相色谱法（HPLC）的实验方法，为医院中药制剂质量标准的提高奠定基础。方法对本院制剂-疳积合剂中威灵仙、使君子，补血复明合剂中何首乌进行薄层鉴别，并通过高效液相色谱法对多动安口服液有效成分芍药苷进行含量测定。结果疳积合剂中威灵仙和补血复明合剂中何首乌在薄层色谱上具有鉴别特征，斑点清晰无干扰，而使君子在薄层色谱中无清晰斑点，还有待研究;初步摸索出HPLC测定多动安口服液中芍药苷的含量方法。结论薄层色谱鉴别方法可用于疳积合剂中威灵仙和补血复明合剂中何首乌的质量控制;高效液相色谱法简便、准确，能精确反映有效成分的含量。

关键词：薄层色谱鉴别法;威灵仙;高效液相色谱法;芍药苷

中图分类号：R285    文献标志码：A    文章编号：1007-2349（2018）05-0073-04

Study on Improvement of Quality Standards for Anti-malnutrition Compounds

WU Xing-long，ZHAO Xue-long，LI Qing，LI Wen

（Traditional Chinese Hospital of Nanjing City，Nanjing 210001，China）

【Abstract】Objective：To establish the basis for improving the quality standards of traditional Chinese medicine compounds in our hospital by TLC and HPLC Methods：The contents of Radix clematidis and Quisqualis indica in anti-malnutrition compounds in our hospital and Polygonum multiflorum in blood-supply and eyesight-improvement compounds were identified by TLC Additionally，HPLC was applied to measure the contents of paeoniflorin in anti-hyperactivity oral agent Results：The contents of Radix clematidis in anti-malnutrition compounds and Polygonum multiflorum in blood-supply and eyesight-improvement compounds were identifiable with clear spots and free of disturbance by TLC，however，Quisqualis indica was not detectable due to obscure spots in TLC We had preliminarily explored the method for determining paeoniflorin content in anti-hyperactivity oral agent Conclusion：TLC can be used to control the quality of Radix clematidis in anti-malnutrition compounds and Polygonum multiflorum in blood-supply and eyesight-improvement compounds HPLC is simple，accurate and can precisely reflect the contents of active ingredients

【Key words】TLC，radix clematidis，HPLC，paeoniflorin

疳积合剂由使君子、威靈仙等7味中药饮片的水煎液提纯加工制备而成，其功效是消积治疳，适用于小儿疳积，腹部膨胀，消化不良等症状。本次实验对疳积合剂中威灵仙、使君子两味中药进行薄层鉴别研究。补血复明合剂由何首乌、白芍、党参等19味中药材的水煎液提纯加工制备而成，补血复明合剂滋补肝肾，健脾益气，养血明目，用于防治近视及各种视力下降，衰老久病之内障眼病[1]。何首乌为主药，对本品中何首乌进行定性鉴别，具有重要意义。

多动安口服液具有滋肾平肝、养心益智、宁神定志的功效，主要由白芍、当归、钩藤等药物组成。根据文献了解白芍主要含有芍药苷等成分[2]，且芍药苷具有多种药理活性[3-4]。因此，实验选用芍药苷作为指标，对多动安口服液中白芍进行含量测定，摸索其高效液相色谱条件，建立含量测定方法，从而增加量化指标，提高质量标准。

1 仪器与试药

1.1.仪器Agilent 1290 Infinity超高压液相色谱仪、VWD紫外检测器（均为安捷伦科技有限公司生产）、色谱柱Diamonsil C18（2），5 um，250×46 mm（济南赛畅科学仪器有限公司）、KQ-500E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）、DH-9241A电热恒温干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）、OK-526电热恒温水浴锅（上海跃进医疗器械产）、AL104分析天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）、研钵、分液漏斗、烧杯、蒸发皿、锥形瓶、移液管、容量瓶（10 mL，25 mL，50 mL）等。

1.2.试药甲醇（分析纯）、甲醇（色谱纯）、无水乙醇、石油醚（60℃～90℃）、石油醚（30℃～60℃）、甲苯、乙酸乙酯、甲酸、硫酸、浓盐酸、氨水等试剂，以上药品均来自南京化学试剂有限公司;10%硫酸乙醇溶液、10%三氯化铁乙醇溶液显色剂（理化实验室配制）;大孔吸附树脂（上海劲凯树脂有限公司）。实验制剂为疳积合剂（南京市中医院 批号：170229）、补血复明合剂（南京市中医院 批号：170710）、多动安口服液（南京市中医院 批号：170231）、石燕（煅）、谷精草、石决明（煅）、威灵仙、使君子、鸡内金（砂烫）、茯苓、何首乌等中药饮片均由安徽沪春堂中药饮片厂提供，芍药苷对照品（批号：110736-201640）购自于中国食品药品检定研究院。

2 方法与结果

2.1.疳积合剂中威灵仙的薄层鉴别

211供试品溶液的制备取疳积合剂55 mL，浓缩至40 mL，加浓盐酸6 mL，水浴加热回流1 h，加水20 mL，放冷，加石油醚（60 ℃～90 ℃）50 mL振摇，萃取，石油醚蒸干，残留物用无水乙醇1 mL溶解，作为供试品溶液[5]。

2.1.2.对照药材溶液的制备称威灵仙药材10 g，置于研钵中，研细，加水100 mL浸泡30 min，煎煮1 h，滤过，滤渣加水80 mL，煎煮1 h，滤过，合并滤液，浓缩至40 mL。同“111供试品溶液的制备”项下同法制成1 mL对照品溶液。

2.1.3.对照品溶液的制备取齐墩果酸对照品，加无水乙醇制成每lm l含045 mg的溶液，作为对照品溶液[13]。

2.1.4.阴性对照溶液的制备按处方比例，取除去威灵仙以外的其余药材，同供试品溶液制备方法制成缺威灵仙阴性对照品溶液。

2.1.5.薄层层析照薄层色谱法[6]试验，分别吸取上述四种溶液50 uL，50 uL，30 uL，10 uL点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（20：3：02）为展开剂，预饱和20 min，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点清晰，在自然光下检视。结果：供试品色谱在与对照药材、对照品色谱相应位置上显相同颜色的紫红色斑点，阴性对照品在相应位置无紫红色斑点。见图1。

2.2.补血复明合剂中何首乌的薄层鉴别

2.2.1.供试品溶液的制备取补血复明合剂20 mL，浓缩至5 mL，加至已处理好的大孔吸附树脂柱（DA-201，15*15-20 cm），使药汁缓慢通过树脂柱（1 mK/min），待药汁吸尽后，继以纯化水200 mL冲洗（5 mL/min），弃去水洗液，再以80%乙醇80 mL冲洗树脂柱（2 mL/min），收集洗脱液，水浴蒸干，残留物以甲醇1 mL溶解，作为供试品溶液。

2.2.2.对照药材溶液的制备取制何首乌对照药材1 g，加水200 mL浸泡30 min，煎煮30 min，过滤，滤液浓缩至5 mL。同“供试品溶液的制备”项下同法制成1 mL对照品溶液。

2.2.3.薄层层析照薄层色谱法（中国药典2015年版一部附录VI B）试验，分别吸取供试品液与对照药材液各10 uL，点于同一块硅胶G板，并使成约1 cm长的横条状，以甲苯-无水乙醇（2：1）为展开剂，展开3～4 cm，取出，晾干，继以甲苯—无水乙醇（4：1）为展开剂，展开约7～10 cm，取出，晾干，置浓氨水缸中熏2～3 min，于日光下检视。结果：供视品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的色斑。见图2。

2.3.含量测定研究[7-8]

2.3.1.色谱条件色谱柱为Diamonsil C18（2），5 um，250×46 mm，以甲醇-水（25∶75）為流动相，柱温室温，流速为1 mLmin-1，检测波长为230 nm。在此条件下，样品中芍药苷与相邻成分达到基线分离，见图3～4。

2.3.2.供试品溶液的制备取多动安口服液2 mL，置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，用02 um的微孔滤膜滤过，即得。

2.3.3.对照品溶液的制备精密称取芍药苷对照品1020 mg，置于25 mL容量瓶中，加甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得04080 mg/mL的储备液。

2.3.4.线性关系试验精密量取上述储备液，用甲醇稀释，配制6种不同浓度对照品溶液，其浓度分别为00408、00510、00816、01020、02040、04080 mg/mL，分别精密吸取10 uL，注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积，以对照品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，根据结果精确绘制标准曲线的回归方程为Y=14955X-29194，r=09999（n=6）。结果表明芍药苷浓度在408～408 ug范围内线性关系良好，见图5。

2.3.5.精密度试验精密吸取芍药苷对照品溶液2040 ug/mL，在上述色谱条件下，进样10 uL，重复进样6，测定峰面积，计算，结果对照品的RSD为022%，结果见表1

2.3.6.重复性试验取同一批样品6份，按供试品溶液制备方法制备，在上述色谱条件下，进样10 uL，测定峰面积，计算含量，芍药苷平均含量为01410 mg/mL，RSD为186%，结果见表2。

2.3.7.稳定性实验精密吸取供试品溶液10 uL，在上述色谱条件下，分别于0、2、4、6、12 h进样，测定峰面积，计算，RSD为098%，结果表明供试品溶液在12 h内稳定，结果见表3。

2.3.8.加样回收率试验精密量取已知含量（批号161231）的多动安口服液2 mL 6份，置于10 mL容量瓶中，分别精密加入相同量的芍药苷对照品，按供试品溶液制备方法制备，分别精密吸取10 uL，测定峰面积，按回归方程计算含量，计算回收率，平均回收率为9723%，RSD 为874%，结果见表4。

2.3.9.样品测定取批号161231的多动安口服液，按供试品溶液制备方法制备，在上述色谱条件下，进样10 uL，测定峰面积，按外标法计算，结果样品中芍药苷的含量为01410 mg/mL。

3 讨论

3.1.疳积合剂

3.1.1.威灵仙的鉴别在威灵仙薄层鉴别实验探索过程中，曾参照王曙等人在华西药学杂志上发表的文章，威灵仙的薄层色谱鉴别中威灵仙供试品溶液制备方法，取疳积合剂20 mL，用10 %硫酸溶液30 mL溶解，沸水浴水解2 h，氯仿萃取2 次，每次30 mL，合并萃取液，浓缩至干，用氯仿1 mL溶解残渣，制成供试品溶液[11]。参照2015版药典记录的威灵仙供试品溶液制备方法[5]，制备威灵仙对照药材溶液，以氯仿-石油醚（5∶10）为展开剂，喷10 %磷钼酸乙醇试液，105 ℃加热，结果供试品溶液、对照药材溶液均未出现斑点。

供试品未出现斑点，分析原因可能是10%硫酸溶液酸性较小，不能使疳积合剂中威灵仙皂苷完全水解。对照药材未出现斑点，分析原因可能是用10mL无水乙醇溶解残留物，浓度较小。还有可能是展开剂极性较小所致。

根据2015版药典记录的威灵仙供试品溶液制备的取样量1 g，医院制剂疳积合剂威灵仙投药90 g，最终制成1000 mL。通过计算，取样疳积合剂11 mL相当于取样威灵仙药材1 g。供试品溶液制备探索过程中，考虑到制剂工艺的特殊性，第一次取样量扩大10倍，即取样疳积合剂110 mL，改用浓盐酸使其水解，其他同“111供试品溶液的制备”项下制成供试品溶液。威灵仙对照药材溶液制备用乙醇提取，浓盐酸使其水解，石油醚萃取，残留物用无水乙醇1 mL溶解，并以极性更大的甲苯-乙酸乙酯-甲酸（20∶3∶02）为展开剂。使用改变后的薄层条件，105℃加热至斑点清晰，自然光下检视，结果见图6。

第2次取样量扩大5倍，即111项下的供试品溶液。点样过程中，分别考察了阴性对照液-供试品液-对照药材溶液-对照品溶液不同点样量（10 uL，10 uL，10 uL，10 uL;25 uL，25 uL，20 uL，10 uL;50 uL，50 uL，30 uL，10 uL），结果表明采用50 uL，50 uL，30 uL，10 uL的点样量，各斑点清晰，见图1。理论上，再应将取样量扩大4倍、3倍、2倍等依次制备供试品溶液，相同薄层色谱条件，考察供试品能否与对照药材、对照品在色谱相应位置出现相同紫红色斑点。由于实验时间限制，未能继续探索。

3.1.2.使君子的鉴别由于使君子药材中含没食子酸，所以参照2015版药典记录的铁笛口服液[13]供试品溶液的制备方法，用乙酸乙酯振摇提取，弃去乙酸乙酯液，水液用水饱和的正丁醇振摇提取，合并正丁醇液，蒸干，残留物用甲醇溶解，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸-水（7∶3∶1∶05）为展开剂，以10%三氯化铁乙醇溶液为显色剂。结果发现没食子酸对照品溶液出现深蓝色斑点，供试品溶液未出现清晰斑点，见图6。

分析原因该制剂的制备工艺中采用水提取，理论上制剂中含有没食子酸，但使君子中化学成分多，另外疳积合剂中药味较多，化学成分更多、更复杂，用上述供试品溶液制备方法難以提取出没食子酸。

2015版药典规定，使君子药材中含葫芦巴碱不得少于020%，用乙醚分别超声提取疳积合剂、使君子药材，滤液蒸干，残渣用乙酸乙酯溶解，分别得到供试品溶液和对照药材溶液，以石油醚（30℃～60℃）-乙酸乙酯为展开剂，10%硫酸乙醇溶液为显色剂，结果对照药材溶液出现灰色清晰斑点，供试品溶液在相同位置未出现斑点。分析原因该制剂为水提液，制剂中脂溶性成分含量偏低，用乙醚提取疳积合剂，供试品溶液中使君子脂溶性成分含量更低，所以在薄层鉴别时，供试品溶液斑点显色不明显。疳积合剂中使君子的薄层色谱中不成功，还有待继续探索研究。

3.2.多动安口服液中芍药苷的含量测定本次实验所选仪器是高效液相与质谱连用，为了不影响以后质谱仪的使用情况，高效液相仪避免使用盐类流动相。所以分别考察了甲醇-01%磷酸（30∶70），甲醇-水不同比例（25∶75∶35∶65），结果表明采用甲醇-水（25∶75）时所得到的色谱图基线平稳，且样品中芍药苷前后之间的峰分离较好，见图4。因此选用甲醇-水（25：75）为多动安口服液中芍药苷的含量测定的流动相。

在加样回收率实验中，平均回收率为9723%，属于正常值，但RSD值为874%，值较大，表明回收率的精度较低。分析原因是在最后两针进样时，仪器柱压明显升高所致。

根据医院制剂质量标准提高的要求，应对同一制剂多个批次进行研究，由于时间限制，以上制剂均只做了一个批次的实验研究，在后期的实验中，会不断研究多个批次，然后汇总数据，进行分析，以准确提高医院制剂质量标准。

参考文献：

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