注射用白眉蛇毒血凝酶止血机制初步研究:白眉蛇毒血凝酶
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[摘要] 目的：初步探讨注射用白眉蛇毒血凝酶（BT）的止血机制。方法：通过研究BT对断尾小鼠出血时间、凝血时间、出血量的影响，BT对兔血小板数量及血小板聚集率的影响；以及对纤维蛋白肽含量的影响，初步探讨BT的作用机制。结果：BT能明显缩短小鼠断尾出血时间、凝血时间并减少断尾出血量；对兔血小板数量及血小板聚集率无明显影响；BT作用于纤维蛋白原，释放纤维蛋白肽A。结论：BT的止血机制为促使纤维蛋白原降解生成纤维蛋白，后者在血管破损处吸附血小板，形成止血栓。
[关键词] 注射用白眉蛇毒血凝酶；药理作用；止血
[中图分类号] R963[文献标识码] A [文章编号]1673-7210（2011）04（b）-047-03
Haemostasis mechanism of action of hemocoagulase for injection
WU Guangtong, ZHANG Xiahua, SHI Yulan
Shanghai People"s Armed Police Corps Hospital, Shanghai201103, China
[Abstract] Objective: To study the haemostasis mechanism of action of hemocoagulase for injection(BT). Methods: Effects of BT on mice clotting time, bleeding time and bleeding loss were determined by mice tail breaking test. Platelet number and platelet aggregation ratio(PAR) in rabbits were measured. We detected fibinopeptide using HPLC. Results: BT could diminish rats bleeding time, clotting time and bleeding loss remarkably. No differences were observed among rabbits in platelet number and platelet aggregation ratio. BT stimulated the degradation of fibrinogen into fibinopeptide A. Conclusion: These findings indicate that BT plays a significant role in hemostasis; the mechanism of action is stimulating fibrinogen into fibrin, the latter can also stimulate platelet aggregation around vascular lesions and accelerate the formation of platelet tampon, thereby accelerating the effect of hemostasis at the site of vascular lesions.
[Key words] Hemocoagulase for injection; Pharmacological action; Haemostasis
注射用白眉蛇毒血凝酶（商品名邦亭，简称BT））是从长白山白眉蝮蛇毒液中分离、提纯、精制而得到的一种血凝酶，其作为一种高效止血药物已广泛应用于临床各种创伤及手术止血[1-3]。为了充分探讨其作用机制，进行如下研究：
1 仪器、试药与实验动物
日本岛津高效液相色谱仪，其中包括LC-10AVP泵、SPD-10Avp检测器、CTO-10Avp柱箱、SCL-10Avp系统控制器，LCsolution1.23色谱工作站。KQ-250B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。SYZ-B型石英亚沸高纯水蒸馏器（江苏宜兴新建勤华石英玻璃厂）。TYXN-96多功能智能血液凝集仪(上海通用机电技术研究所)。
注射用白眉蛇毒血凝酶（锦州奥鸿药业有限责任公司，产品批号20100112，1 KU/支），人纤维蛋白原（Fig）冻干粉（上海市生物制品研究所，批号20090701），纤维蛋白肽A（FPA）和纤维蛋白肽B（FPB）对照品（美国Sigma公司，货号F3254和F3379）。
一级昆明种小鼠，体重18~22 g，雌雄各半；日本大耳白兔，体重2.0~2.2 kg，雌雄各半（辽宁医学院实验动物中心，动物合格证号：SCXK(辽)2003-0007号）。
2 方法与结果
2.1小鼠凝血时间和出血时间的测定
取健康小鼠60只，随机分为4组，每组15只。第Ⅰ组为空白对照组，尾静脉注射等容量注射用水；第Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组为BT低、中、高剂量组，剂量分别为0.5、1、2 KU/kg。给药后30 min，用锋利的刀片在距小鼠尾尖0.5 cm处快速切断，将小鼠断尾放入装有5 ml，37℃保温的生理盐水玻璃离心管中，用注射器针尖挑动至出现凝血纤维丝所历时间，记为小鼠凝血时间（ct）。另外当血液自行流出后立即计时，每隔15 s，用吸水纸轻触尾部断处，直到断尾处不再有血液流出（无血丝出现），这段时间记为出血时间（bt）。由表1可知，注射不同剂量BT后，凝血时间和出血时间均较对照组明显降低（P 本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文 血小板聚集率的测定：TYXN-96多功能智能血液凝集仪检测样品1、5 min及最大血小板聚集率（PAG）。经统计，血小板数量和血小板聚集率与对照组无显著性差异（表2）。
表2注射用白眉蛇毒血凝酶对兔血小板数量
和血小板聚集率的影响（n=8,x±s）
Tab.2Effect of BT on platelet number
and platelet aggregation ratio(n=8,x±s)
2.4纤维蛋白肽含量的测量
按照文献[4]的方法，以0.05 mol/L Tris-HC1(pH 7.4)分别配制10 mg/ml Fig溶液、0.03 mg/ml BT、7 U/ml人凝血酶溶液。以上溶液配制后均于37℃充分温浴后使用。每次取 Fig 溶液1.0 ml加入1.5 ml Ependof 管，加入注射用白眉蛇毒血凝酶溶液0.17 ml，37℃下分别温浴10、120 min。另取Fig溶液1.0 ml，加人凝血酶溶液0.17 ml，37℃下温浴120 min。温浴结束后于100℃沸水中煮5 min，以终止反应，产物经 15 000 r/min离心10 min，取上清，为供试品溶液。FPA和FPB对照品用流动相配制成约20 μg/ml的对照品溶液。
HPLC条件如下：色谱柱：Hypersil ODS(4.6 mm×200 mm)。流动相：含0.05 mol/L三乙胺的0.1mol/ml 磷酸，pH 3.0，用时按体积比39∶61将甲醇和磷酸溶液混合，以0.21 μm微孔滤膜滤过并脱气。流速1 ml/min；柱温30℃，检测波长210 nm；上样50 μl。
图1~4结果显示，纤维蛋白原与凝血酶作用，高效液相色谱先后出现了纤维蛋白肽A（FPA）和肽B（FPB）两个峰；图5结果显示，纤维蛋白原与注射用白眉蛇毒血凝酶作用，只出现FPA峰，无FPB峰；图5，6结果显示，纤维蛋白原与注射用白眉蛇毒血凝酶作用，FPA出峰时间和峰值在10~120 min内保持稳定。
2.5数据处理与统计分析
SPSS 13.0统计软件进行统计分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组间数据比较采用t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析。
3 讨论
血液中的血小板、血浆中的各种凝血因子与抗凝因子以及毛细血管壁的完整性，其中任何一项发生异常，均可造成临床上的出血倾向；而且各种外科创伤或手术可能导致严重的出血，尤其在心血管手术、肝移植和肝切除手术中等出血量是比较大的，因此行之有效、安全的止血药物是挽救临床出血性患者的迫切需要。注射用白眉蛇毒血凝酶是从长白山白眉蝮蛇蛇毒中提取纯化，用于止血的血凝酶，该药在血管损伤后的止血过程中发挥着重要的作用[5]。本研究发现，注射用白眉蛇毒血凝酶可以缩短断尾小鼠出血、凝血时间，减少出血量，与对照组比较具有显著性差异，这与临床报道一致。而对兔的血小板数量和血小板聚集率没有明显的影响，对ADP 诱导的血小板聚集无明显的抑制作用，所以在血管无破损情况下，不能引起血小板黏附聚集。此结果与国内报道的同类蛇毒类凝血酶性质相一致[6]。本研究结果显示纤维蛋白原与注射白眉蛇毒血凝酶作用只生成纤维蛋白肽A，不生成纤维蛋白肽B，推测注射用白眉蛇毒血凝酶水解纤维蛋白原的α链，释放纤维蛋白肽A，同时生成可溶性的纤维蛋白Ⅰ单体，后者在血管破损处聚合为纤维蛋白Ⅰ多聚体，从而促进血小板聚集、加速血小板止血栓的形成并加以巩固，在血管破损处达到初期止血效应的[7]。基础和临床验证有效剂量的血凝酶不打破凝血纤溶平衡，凝血四项在用药前后均无显著性差异，因而不会在正常血管内形成血栓[5,8]。因此，结合本研究可以认为注射用白眉蛇毒血凝酶是一种高效、安全的酶类止血药。
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（收稿日期：2011-01-28）
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