兔巴氏杆菌-波氏杆菌二联蜂胶疫苗的研制及安全、效力试验
时间：2021-11-01 15:27:09 来源：达达文档网 本文已影响 人 
兔巴氏杆菌-波氏杆菌二联蜂胶疫苗的
研制及安全、效力试验
兔多杀性巴氏杆菌病(Pm)和兔支气管败血波氏杆菌病(Bb)是家兔的两种主要细菌性传染病,它们传播迅速,一旦在兔场暴发流行,很难根除,经济损失惨重。进行疫苗接种是预防这两种疾病的最有效的措施。免疫原性好的菌(毒)种和良好的免疫佐剂是保证疫苗免疫效力的必要条件。因此,在Pm和Bb基础菌种研究的基础上,对蜂胶的提取工艺进行了研究,选取了蜂胶乙醇提取液的水溶物作为佐剂,研制疫苗,并进行了疫苗的安全及效力试验。现将该研究结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 仪器及材料
1.1.1 菌种 兔多杀性巴氏杆菌Pm90株(对家兔的致死剂量为8-10个活菌,对小鼠的致死剂量为100个活菌);兔支气管败血波氏杆菌Bb82株(对小鼠的致死剂量为1×107个活菌,对家兔的致病剂量为1×108个活菌)。
1.1.2 试验动物 不同日龄的健康大耳白兔
1.1.3 培养基 含3%小牛血清的马丁琼脂平板(SMS)、马丁肉汤(MB)、硫乙醇酸盐培养基(T.G)、酪胨琼脂(G.A)、葡萄糖蛋白胨汤(G.P)等。
1.1.4细胞瓶
1.1.5 蜂胶
1.1.6 仪器 GQ(F)—75管式分离机、索氏回流装置、温控式旋转蒸发器
1.2 试验方法
1.2.1 Pm90菌液的制备及检验
1.2.1.1一级种子的繁殖与鉴定 用灭菌生理盐水适当稀释Pm90株第9代冻干菌种,接种于0.1%绵羊血红素的马丁琼脂平板(BMS)上,37℃培养18h,然后选取5-10个典型菌落,分别接种于10%绵羊鲜血琼脂斜面若干,同上培养后,作为一级种子。在4℃保存,可使用7日。继代次数不超过3代。
1.2.1.2二级种子的繁殖及鉴定 将Pm90株一级种子接种于适量马丁肉汤中,置37℃振荡培养18h,取样用SMS培养基作纯粹检验;置4℃保存,可使用3日。
1.2.1.3制苗用菌液的培养 将Pm90株二级种子接种于SMS培养基,37℃培养18h,无菌水洗下菌苔,取样做纯粹检验,同时用平板菌落计数法计算菌液浓度,将菌液浓度调整为200×108个/ml。
1.2.1.4菌液的灭活 加入0.4%的甲醛溶液于菌液中,容器密封后,37℃灭活48h,其间振摇6-8次,然后进行灭活检验。本研究灭活检验及无菌检验用的培养基为:SMS、T.G、G.A和G.P。置37℃条件下培养48h,无细菌生长说明已完全灭活。
1.2.1.5菌液的离心、冻融 灭活检验合格的菌液用管式分离机离心除去甲醛,无菌刮下菌苔,用等量的灭菌生理盐水配成原浓度的菌液。小量分装后反复冻融3次,再次进行无菌检验。
1.2.2 Bb82菌液的制备与检验 将Bb82株第7代冻干菌种接种于BMS培养基上,37℃条件下培养24h,然后选5-10个典型菌落,分别接种于10%绵羊鲜血琼脂斜面若干,同上培养后,作为一级种子。置4℃保存,可使用7日。继代不超过3代。二级种子的繁殖以及制苗用菌液的培养、灭活、离心及冻融参照1.2.1
1.2.3 蜂胶佐剂的制备 经过工艺优化选择,我们采用了醇提水溶法来制备蜂胶佐剂。蜂胶原胶在-20℃冰柜中冷冻过夜使变脆,取出后研磨粉碎,放入深色瓶中,按1：4的比例加入80%的乙醇,充分搅拌,置70℃索氏回流2h,然后于旋转蒸发器中50℃浓缩成浸膏状。通过试验,选择合适的助溶剂,将蜂胶浸膏溶于pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS),然后配制成40mg/ml的溶液4℃避光保存备用。
1.2.4 配苗 将上述Pm90菌液与Bb82菌液等量混匀后作为水相,蜂胶乙醇提取液作为佐剂相,水相与佐剂相等量混匀后加入终浓度为0.01%的硫柳汞,置胶体磨中以8000r/min搅拌5min,然后12000r/min搅拌5min。无菌检验合格的,即可分装至疫苗瓶中,加塞、封蜡置4℃保存备用。实验室共生产兔巴氏杆菌-波氏杆菌二联蜂胶疫苗6批,批号分别为:010510、010521、010615、010628、010709和010720。
1.2.5成品检验 6个批次的兔巴氏杆菌-波氏杆菌二联蜂胶灭活疫苗均进行了物理性状、无菌检验以及安全检验。其中安全检验分3组进行,每组均使用了不同日龄(30、90、180天)的健康大耳白兔各20只。接种后观察3周,记录家兔的临床反应、体温以及是否有组织病变。3个组的试验设计如下:一次单剂量接种组的疫苗接种量为2ml/只;单剂量重复接种组为2次接种,中间间隔1周,剂量为2ml/只;一次大剂量接种组的疫苗免疫量为6ml/只,采用皮下多点注射的方式进行。
1.2.6 兔巴氏杆菌—波氏杆菌二联灭活苗的效力试验 兔巴氏杆菌部分取4批二联苗(批号:010521、010615、010709、010720),分为3个免疫剂量:1、2、3ml,分别注射1月龄左右的健康家兔各20只,5只作正常对照。3周后每只接种Pm90株致死量,观察14天,记录每组的死亡数。
兔波氏杆菌部分取4批二联苗(批号:010615、010628、010709、010720),分为3个免疫剂量:1、2、3ml,分别注射1月龄左右的健康家兔各20只,5只作正常对照。3周后每只接种Bb82株致病量,以家兔咳嗽、鼻腔排出水样或脓样的鼻液,取鼻腔拭子能分离到Bb82株作为发病标准。观察14天,记录每组的发病数。
2 结果
2.1 疫苗的物理性状检验
本品为棕黄色均匀混悬液,长期静置后底部有少许沉淀,可混匀。
2.2 疫苗的无菌检验
待检菌液在SMS、T.G、G.A、G.P培养基上进行无菌检验,均无细菌生长。
2.3 疫苗的安全性检验
各批次的疫苗接种家兔后,家兔的体温、食欲无明显变化,注射部位也无红肿及硬结。
2.4 疫苗的效力试验
2.4.1 家兔对巴氏杆菌的免疫保护试验结果 对照组的家兔在3天内全部死亡,从兔体的心、肝、脾、肾中都分离到了巴氏杆菌。2ml以上试验组的死亡保护率均在90%以上(见表1)。
表1 家兔对巴氏杆菌的免疫效力试验 | ||||
批次 | 攻毒保护率（﹪） | |||
1ml组 | 2ml组 | 3ml组 | 对照组 | |
010521 | 60 | 95 | 95 | 0 |
010615 | 60 | 90 | 100 | 0 |
010709 | 55 | 100 | 100 | 0 |
010720 | 65 | 95 | 90 | 0 |
2.4.2 家兔对波氏杆菌的免疫保护试验结果 对照组的家兔在3天内全部发病并自鼻腔拭子中分离到了兔支气管败血波氏杆菌,2ml以上试验组的发病保护率均在90%以上(表2)。
表2 家兔对波氏杆菌的免疫效力试验 | ||||
批次 | 攻毒保护率（﹪） | |||
1ml组 | 2ml组 | 3ml组 | 对照组 | |
010615 | 70 | 100 | 90 | 0 |
010628 | 60 | 95 | 100 | 0 |
010709 | 75 | 100 | 95 | 0 |
010720 | 65 | 95 | 90 | 0 |
3 结论与讨论
3.1 关于菌液的生产工艺
制苗用兔巴氏杆菌及波氏杆菌菌液的培养采用了(血清)马丁琼脂平板培养的方法,不仅容易得到高浓度的纯菌液,也避免了液体培养时菌液中非抗原物质对动物机体的影响;菌液灭活后经管式分离机离心去甲醛,从而避免了疫苗中的非抗原性化学物质对动物造成不必要的刺激;离心后的菌液经反复冻融,可使细菌的细胞壁破裂或通透性增加,细菌细胞内的多种抗原成分被释放出来,这样配苗时各抗原组分与蜂胶佐剂的相互作用更加充分,从而可增强疫苗的免疫效果。
3.2 关于蜂胶佐剂的提取工艺
蜂胶疫苗自问世以来,已在多种畜禽传染病的预防中得到应用。遗憾的是,用于疫苗佐剂的蜂胶,大多是蜂胶的乙醇粗提液。本研究中,我们采用了80%的乙醇来提取蜂胶,既能提取到蜂胶中的黄酮类等醇溶成分,又能保留一部分水溶性的活性物质。所得的蜂胶醇提液用温控式旋转蒸发器蒸发掉乙醇,然后通过大量试验,选择了适当的助溶剂,使蜂胶浸膏可以以任意比例与水互溶,这样就避免了乙醇对动物体强烈的刺激作用,增强了疫苗的安全性。疫苗的效力试验表明,我们选择的这种助溶剂不会降低蜂胶的佐剂效应。值得注意的是,目前市场上的蜂胶原胶质量良莠不齐,掺假现象时有发生,选择优质的原胶才能保证其提取物良好的佐剂效应。
3.3 对兔巴氏杆菌-波氏杆菌二联蜂胶灭活苗的评价
经不同日龄家兔的单剂量单次免疫、单剂量重复免疫以及大剂量单次免疫试验,表明本疫苗安全无毒副作用,适用于30日龄以上的家兔使用，使其产生坚强的免疫保护作用。
